应用指南：怎样做才能提高测量NPQ的准确性

北京澳作生态仪器有限公司

2020/11/30 09:48

应用指南：怎样做才能提高测量NPQ的准确性

非光化学淬灭系数NPQ，反映了植物热耗散过剩光能为热的能力，反映植物的光保护能力。当叶子从黑暗转移到光照条件下时，光系统II（PSII ）反应中心逐渐关闭，这使得（在光照第1秒左右）产生叶绿素荧光产量的增加。然而之后荧光水平通常在几分钟内开始再次下降。这种称为荧光淬灭（fluorescence quenching）的现像可以用两种方式解释:电子从光系统II传输的速率有所增加，这主要是由于光诱导的碳代谢活化和气孔开启所致。这种淬灭称为“光化学淬灭”（photochemical quenching）。与此同时，能量转化为热量的效率也在提高，这个过程称“非光化学淬灭”。这种机制会使得植物吸收的光能不再被用于光合作用，而是直接转化为热能耗散掉，从而避免植物遭到强光照的伤害。当光照强度恢复正常时，非光化学淬灭又会被关闭，植物重新回到正常的光合作用。

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图1 光能的利用方式

非光化学淬灭系数NPQ是测量叶绿素荧光时经常会用到的参数，但是大家对这个参数了解的并不深人，NPQ的测量受哪些因素影响，以及如何才能提高测量的准确性还有很多值得探讨的地方。为了获得可靠的测量结果，我们建议大家考虑以下一些因素。

1、需要知道植物的光照历史，来确定合适的暗适应时间。

通常，叶黄素循环和类囊体腔酸化恢复到暗适应状态仅需几分钟。但是，状态转换则需要15到20分钟。这些时间在田间植物中可能会有所不同，并且可能需要更长的时间（Baker 2004）。此外，暴露于光抑制条件下数小时的野外植物和其他植物会在30至60小时内保留一定量的NPQ（Lichtenthaler 2004）。这就是说在夏季测量田间植物的淬灭参数时，即使暗适应过夜，仍然会有残留的NPQ存在，因此，重要的是仅比较具有相似光照历史的样品。在野外植物上进行淬灭测量时，研究人员通常会选择黎明前的暗适应值。通常不使用较短的暗适应时间来研究淬灭。

2、设置合适的调制光强

Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm, 表示最大光化学效率。Fo是在非常低的调制光下测得的最小荧光，这个非常低的调制光，需要能激发荧光，但又不能过高，驱动反应中心的光化学还原，因此设置一个合适的调制光强是关键。调制光强通常需要手动设置，美国Opti公司生产的荧光仪OS5p+/OS1p则加入了“自动设置”调制光强的功能，这样就使得设置调制光强变得更方便也更准确。

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图2 自动设置调制光强功能

3、荧光淬灭测量需要有稳定光化光照射。

进行荧光淬灭参数测量通常至少要花费30min的时间，甚至更长。为了得到准确的测量结果，植物必须处于稳态光合作用状态下。而要使植物达到稳态光合作用状态，通常需要使用荧光仪内置的人造光源提供光化光，要求光化光的输出要比较稳定。

大多数品牌的荧光仪，光化光的强度输出会随时间变化。当光化光打开时，荧光仪会变热导致光强输出降低。光化LED光源输出的强度随着温度而变化。

美国Opti公司的OS5p+荧光仪使用PAR叶夹测量光化光输出，利用内置闭环回路反馈程序随时调整光源的强度，从而使得光强长时间保持在一个恒定的水平，上下偏移不超过3umols。测量期间光化光强度的变化可能会造成严重的测量误差。

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图3 创新的PAR叶夹，余弦校正

4、饱和脉冲持续的时间

对于高等植物，持续时间应该在0.5s到1.5s之间(Rosenqvist and van Kooten 2006)，对于浮游植物和蓝藻细菌，持续时间应该在25ms到50ms之间(Schreiber 2005)。超出这个时间范围会增加Y(II)和淬灭测量的误差。如果持续时间较短，可能无法完全饱和PSII；较长的持续时间又会出现饱和脉冲NPQ现象（饱和脉冲最大值的末端变圆），这样就会减小平均最大饱和脉冲（Rosenqvist and van Kooten 2006）。

OS5p+和OS1p使用25ms8点滑动平均的特殊算法，取25ms平均值的最大值作为最大荧光值Fm和Fm’，此种方法有效的防止饱和脉冲NPQ引起的误差。这样可以确保只要饱和脉冲宽度足够宽，就可以得到正确的值。

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图4 25ms8点滑动平均算法

5、饱和脉冲的强度

阴生的植物叶片几百umols的光强就可以饱和，阳生的叶片通常在1500umols光强下可以饱和(Ralph 2005).如果饱和光闪在黑暗的环境下发生得太频繁，虽然强烈的饱和光闪强度不会损伤光适应的样品，但可能在冻害胁迫条件下损伤暗适应的样品。

对于单次测试，暗适应条件下的强光闪不会有问题，但对于较长时间的测试（例如荧光淬灭的测量）则需要考虑饱和光闪的频率。建议在所有淬灭测量中都要使用最大饱和光强。在晚上测试时，饱和脉冲应该间隔至少十分钟到一小时，防止饱和脉冲造成的光损伤（Porcar-Castell A. 2008）。

另外，对于有高光照历史的植物，即使使用最大的饱和光闪强度，也可能无法全部还原PSII反应中心，这种情况下，如果使用通用的方形饱和光闪模式，Y(II)，Fm’、ETR等的测量误差高达30%。为解决这个问题，美国Opti公司的荧光仪嵌入了多相饱和光闪模式，使用较低的饱和光闪强度照射样品测得相应的最大荧光值，然后采用最小二乘法线性回归的方式，算出极高光强下的最大荧光值，用于修正Y(II)、Fm’和ETR。这种方法不仅可以降低测量误差，还避免了强饱和光闪对植物的光合反应中心造成损伤。

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图5 多相饱和光闪模式基于Loriaux 2013 Fm’ correction protocol

6、淬灭弛豫参数的测量

研究已经证实淬灭弛豫方式主要包括叶黄素循环qE、叶绿体迁移qM、状态转换qT和光抑制qI，反映了植物对环境胁迫和变化的保护性调节。准确计算四个分量有助于从光合特性的角度深层次研究植物的抗性机理。

NPQ =qE+qM（qT）+qI，准确区分和精确量化四个组分可以提高测量非光化学淬灭NPQ的精确性。四组分可用于抗性品种的鉴定，Goss和Lepetit（2015）使用光保护性成分qE、qM鉴定抗性品种。各种研究人员提出了计算NPQ分量的正确方法（Maxwell and Johnson 2000，Guadagno et al.2010，Rohá?ek2010，Kasajima et al.2015，Tietz et al.2017）。