综述 | 质谱成像技术及其在药物研究中的应用进展

质谱成像（Mass Spectrometry Imaging，MSI）是对样本表面及其纵深的组成分子直接进行解吸、电离和检测，并最终以离子图像形式展示各组成分子空间分布的技术。MSI 技术能够在保留空间信息的同时，特异性地解析药物及其代谢产物在给药样本中的分布，从而便于直接观察药物的药代动力学过程，包括吸收、分布、代谢和排泄。MSI 技术还能同时检出多种类型的内源性分子，包括蛋白质、糖链、代谢物和脂质，这些分子在不同生理区域具有独特的分布模式和生物功能。这种物理空间可分辨、化学分子特异性区分的双重技术优势，使质谱成像在探索候选药物药动学、药效学性质以及分子机制等方面极具应用价值。

2022年12月，复旦大学、斯坦福大学化学系宋肖炜博士作为通讯作者，与斯坦福大学医学院李超博士、厦门大学化学系孟一凡博士在 Acta Materia Medica 上合作发表了题目为“Mass spectrometry imaging advances and application in pharmaceutical research”的综述文章。作者详细介绍了 MSI 技术在药物研究和开发中的应用，包括其在药物分布、药代动力学、药效学特性、安全性评估以及分子机制探索中的重要性。文章强调了 MSI 技术能够提供药物及其代谢产物在生物样本中的空间分布信息，同时讨论了技术的优势、挑战和最新进展，并展望了未来的发展方向，如提高灵敏度、改善空间分辨率和扩展可检测物种的范围等。此外，还总结了 MSI 在临床前药物研发和临床药物评估中的应用案例，展示了其作为药物研究中一个强大分析工具的潜力。

质谱成像（MSI）在临床前药物研究中的一般工作流程：

样本准备：给药后的实验动物在设定的时间点被安乐死后，立即采集其全身样本。

冷冻固定：将采集的样本冷冻并固定在包埋凝胶中，为后续的冷冻切片做准备。

冷冻切片：进行冷冻切片，并将切片固定到载玻片或特定靶板上。

基质喷涂：采用 MALDI MSI 检测的样本，经过充分干燥后，进行基质喷涂，通常采用全自动基质喷涂装置进行。

原位离子化：使用原位离子化探针（脉冲激光/离子束或连续电喷雾/等离子体等）对冷冻切片样本进行扫描。

数据采集：外源性药物和内源性成分在每个离子化区域被瞬间解吸、离子化，并传输到质谱系统进行 MSI 数据采集。

可视化呈现：MSI 软件根据每个物理位置的离子强度重建分子图像，以目标离子的确切 m/z 为中心，定义质量窗口和质量容差。

MSI 技术相对于其他药物分布研究方法的技术优势，具体包括以下7点：

1. 高特异性：MSI 能够基于质荷比（m/z）的差异，轻松区分药物原型及其代谢产物。

2. 广泛的质荷比通道：与基于荧光或红外的光谱成像技术相比，MSI 能够提供数千个可用的 m/z 通道，用于记录离子信息。

3. 样本预处理流程简便：MSI 的优势之一是无需复杂样本前处理，这与需要提取、纯化和富集的液相色谱-质谱（LC-MS）方法形成对比。

4. 直接从组织表面解吸和离子化：MSI 能够直接从生物组织样本表面解吸并离子化分析物，这有助于在亚器官、组织微区或细胞水平上保留更精确的药物定位信息。

5. 空间分辨率：MSI 技术能够根据离子探针的物理尺寸，在亚器官水平或细胞水平上提供详细的空间信息。

6. 多模态成像：MSI 可以与光学显微镜成像、免疫组织化学（IHC）、分子成像和核医学成像技术等其他成像方式相结合，以获得更全面的生物样本信息。

7. 药物和代谢物的共定位：MSI 能够同时获取药物分子和内源性代谢物的图像，有助于研究药物的作用机制和代谢途径。

这些技术优势使得 MSI 成为药物研究中一个强大的分析工具，尤其是在探索药物的药代动力学、药效学和安全性方面。

文章强调了 MSI 中多种原位离子化技术的选择和重要性，包括激光、离子束、等离子体和带电微滴喷雾等方法，每种方法都有其特定的优势和局限性。在选择适合的离子化技术时，需要权衡灵敏度与空间分辨率，并考虑药物的物理化学性质、样本的物理尺寸和感兴趣的生理结构，以实现对药物及其代谢产物在生物样本中精确的空间分布进行成像。

表1. 药学中质谱成像实验的原位电离方法

文中强调了质谱成像技术在药物分析中面临的灵敏度挑战，由于生物样本的复杂性导致的基质效应可能会降低药物分子的离子化效率。文章讨论了提高 MSI 灵敏度的多种策略，包括开发新的后电离技术和二次电离技术、改进 DESI 配置、使用新型功能基质和纳米材料、进行组织化学衍生化、溶剂浸泡以及利用水凝胶进行样本处理。同时指出，为了确保数据的准确性，需要通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等传统方法对 MSI 获得的低剂量药物分布结果进行验证，以避免假阴性结果的发生。

文中概述了质谱成像数据获取的过程，强调了高性能质谱仪如轨道阱、四极杆飞行时间（QTOF）和傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）在空间组学研究中日益增长的数据量方面的重要性。这些高精度质谱仪不仅提供了丰富的表型信息，还能通过全扫描模式获得精确的 m/z 值，有助于离子身份的可靠注释。此外，文中还提到了三重四极杆和线性离子阱等低分辨率串联质谱分析器在特殊情况下的应用，以及选择反应监测（SRM）作为针对低浓度药物和活性/毒性代谢产物的替代选择。文中还讨论了离子迁移质谱（IMS）技术在同分异构体分离方面的技术特点，以及它如何为分子轮廓分析和 MSI 可观察物种范围的扩展提供了新的维度。

质谱成像（MSI）产生的大数据需要通过特定的软件或自编代码进行处理，以转化为具有空间分辨率的分子信息。文中提到了多种可用的 MSI 软件，它们能够进行基本的数据预处理，如质量峰值识别、数据对齐和标准化，并具备离子图像构建、目标区域（ROI）圈选和平均质谱图生成等功能。此外，还介绍了多变量分析、机器学习和深度学习等先进方法在 MSI 数据处理中的应用，这些方法有助于自动空间分割、离子选择、特征提取、数据降维、3D 图像构建以及多模态成像数据的整合，从而提高了 MSI 数据的分析深度和应用范围。

表2. 可用的质谱成像数据分析软件、软件包或平台

*NS：未指定。**3D：3D成像；QMSI：定量 MSI ；AVG：平均质谱生成；BDP：大数据处理；ROI：兴趣区域选择；预处理：光谱预处理步骤包括取峰、基线平滑、数据变换；MIO：多模图像叠加；Seg：空间分割；Stat：统计描述和特征提取；ML：机器学习；I/E：进出口；FS：特征选择；API：应用程序编程接口。

文中还讨论了 MSI 在定量分析中的应用，指出 MSI 技术能够根据组织切片中归一化离子强度展示药物的相对丰度，但同时也面临着由于组织结构和组成的异质性导致的离子化效率变化，这可能会扭曲药物离子强度与局部浓度之间的线性关系。为了克服这一问题，发展了定量 MSI（QMSI）方法，通过使用氘代内标、化学计量校准或组织信号消光系数的外部评估来补偿组织特异性的离子抑制效应。此外，还介绍了将药物和内标稀释系列纳入空白组织中以模拟剂量的多种策略，以及激光捕获微切割（LCM）技术用于收集组织感兴趣区域进行后续的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测量。通过这些方法，QMSI 能够提供准确的药物空间分辨含量差异，为药物代谢和药代动力学（DMPK）研究中的药物定量提供了一种有效的工具。

在生理结构中精确定位药物分子的重要性，以便了解药物在目标和非目标区域的分布情况。文章指出，药物离子图像本身无法提供完整的组织轮廓和结构微区的准确图，但可以通过三种策略获得区域指导图：（1）使用区域特异性的内源性代谢物作为标记物，例如血红素可以描绘血管；（2）基于 MSI 数据的驱动空间分割，利用机器学习或深度学习方法根据分子轮廓模式将所有生物图像像素分组为微区；（3）通过光学显微镜图像、免疫组化、分子成像技术或核医学成像技术等补充图像获得。这些策略有助于更准确地理解药物在组织中的分布，为药物的疗效和安全性评估提供了重要的空间信息。

文中提到，药物和代谢产物在组织中的分布可以通过 MSI 技术在空间上得到解析，这有助于深入了解药物的药代动力学特性，包括吸收、分布、代谢和排泄（ADME）。MSI 技术能够区分药物和代谢物，并且能够区分血管和非血管区域，使其非常适合 DMPK 研究的需求。此外，文中还讨论了 MSI 在动物模型中可视化药物空间分布的应用，以及如何通过 MSI 观察药物在复杂的亚器官结构或微区室中的分布。

图2. MSI 在制药研究中检测的生物样品的物理尺寸跨度。（a）候选药物 LXY6006 在小鼠全身切片上的 AFA-DESI-MS 图像。（b）Fosdevirine 半胱氨酸共轭物在家兔大脑矢状面分布的 MALDI-MS 图像。（c）异种移植肿瘤切片中紫杉醇衍生物前药异质富集的 AFA-DESI MS 图像； （d）DESI-MSI 显示的利多卡因穿透人体皮肤的情况。（e）MALDI-IMS 分析伊立替康在肿瘤球体中的时间依赖性渗透。（f）微透镜光纤激光解吸质谱成像检测吖啶黄碱培养单细胞图像。

MSI 技术能够同时获取不同类型的内源性代谢物，这些空间分辨的表型变化包含了与疾病进展和药物作用相关的功能性分子信息。药理学家可以通过分析药物作用下受靶酶或转运体调控的下游代谢物，来评估药物的疗效。此外，MSI 技术还有助于探索潜在的药物靶点，筛选功能性代谢标记物，并研究可能的分子机制。文中提到了使用 MSI 技术进行的多项研究案例，包括对胶质母细胞瘤患者衍生的异种移植（PDX）模型的补充分析，以及使用 AFA-DESI-MSI 技术监测抗失眠药物候选物 NHBA 及其内源性代谢谱在整体大鼠切片中的时空变化等。

图3. MSI 应用于空间药物代谢组学和分子机制研究中的典型病例。（a）N⁶-(4-羟基苄基)腺嘌呤核苷（NHBA）处理后大鼠全身组织切片中六种内源性代谢物的时空可视化呈现。（b）脑矢状面代谢物显著变化的图像和基于代谢网络的空间相关图。对照组采用学习记忆障碍模型大鼠，药物组为东莨菪碱治疗的模型大鼠。

文章还讨论了在药物发现的早期阶段，如何利用体外高通量筛选（HTS）来评估化合物对生物靶标的结合活性，并从中筛选出具有潜在活性的小分子。这一过程需要一种稳健且可靠的体外评估方法，以便在不同的化学结构和测试浓度下反映化合物的活性。MSI 技术因其无需标记和多重检测的能力，在 HTS 过程中得到了越来越多的应用。文中提到了使用 MSI 技术对 2D 和 3D 培养的单细胞进行活性评估和候选药物筛选，以及使用 MALDI-MSI 结合荧光显微镜评估阿霉素包裹的脂质体在 3D 细胞球体中的渗透，还有使用超疏水-亲水滴微阵列（DMAs）进行基于 MALDI-MSI 的高速细胞分析平台的构建等案例。这些应用展示了 MSI 技术在体外药物评估和高通量筛选中的潜力和多样性。

图4. MSI 在体外药物评价中的代表性研究案例。（a）给药后单细胞的光学图像和质谱图像；（b）药物处理的 HeLa 细胞内氯甲基硫离子的二维和三维图像。

MSI 技术不仅能够提供原药及其有毒代谢产物在体内的原位证据，还能够将区域分子特征与组织病理学信息相关联，从而有助于揭示对受影响组织区域的副作用或毒性背后的分子机制。文中提到了 MSI 在研究器官特异性和慢性毒性（如肝毒性、肾毒性、肺毒性、眼毒性和神经毒性）方面的应用案例。例如，蔡宗伟团队结合 MALDI-MSI 和基于 MS 的脂质组学揭示了双酚 S 诱导的小鼠肾毒性脂质代谢产物的不对称空间分布。Castellino 等人领导的团队在 GlaxoSmithKline 公司研究了 HIV 非核苷类逆转录酶抑制剂 fosdevirine（FDV）在中枢神经系统中的代谢和毒性。此外，还提到了斑马鱼及其幼虫或胚胎作为遗传学和毒理学研究中的重要脊椎动物模型，以及使用 DESI-MSI 研究地西泮及其氯化消毒副产物2-甲基氨基-5-氯苯酚在斑马鱼中的分布和代谢。这些案例展示了 MSI 技术在药物安全性和毒性评估中的实用性和重要性。

图5. MSI 在药物安全性和毒性研究中的病例。(a) fosdevirine (FDV) 及其半胱氨酸偶联代谢物（M22）在猴（左[M帐1]）、兔（中）和迷你猪（右）矢状脑切片中的分布和代谢。左离子图为 FDV 分布，中、右离子图为 M22 分布。(b) MALDI（左）和 DESI（右）获得的剂量斑马鱼幼鱼氯氮平离子图像。

MSI 还能够精确定位植物中的活性成分，并监测这些成分在加工过程中的变化。尽管存在技术挑战，如天然产物含量低、植物细胞壁的保护作用以及植物代谢组数据库的不足，但通过开发新型纳米材料和化学衍生化方法，MSI 技术已经在植物样本分析中取得了进展。例如，利用 SALDI 成功成像了植物中的多种活性化合物，并且通过 DESI-MSI 技术研究了生物碱在大鼠脑区的分布，以及人参中皂苷的时空变化。这表明 MSI 技术有潜力成为研究药用植物和天然产物的有力工具。

图6. MSI 在药用植物化学中应用的代表性案例。(a)异鼠李素、槲皮素-3β-葡萄糖苷和长春花碱在整片菊花花瓣上的定位。(b)三七根剖面中三七皂苷- R1和人参皂苷- Re的分化分布；(c)同一三七根的生三七和蒸制三七组织；(d)三七皂苷- R1和人参皂苷- Re在流化过程中的含量和分布。

作者分享了对 MSI 作为更好的多重分子成像技术发展方向的个人观点，并强调了这些领域对 MSI 研究的重要性。作者认为尽管 MSI 在药物研究的临床前和临床阶段已被证明是一个强大的工具，但仍有进一步提高技术和方法的空间。以下是文中提到的一些关键发展方向：

1. 灵敏度提升：需要开发更灵敏的原位软电离方法，以便从亚细胞级别的微小区域内获取有效的分子分布信息。

2. 空间分辨率：提高空间分辨率是获取更精确空间信息的关键，可以通过多模态图像融合策略实现。

3. 可检测物种的覆盖范围：MSI 应成为能够适用于所有类型的功能性蛋白质、糖、代谢物和药物的通用分子成像方法。

4. 测试对象的多样性：MSI 研究的生物样本应涵盖更广泛的类型，包括临床病理中使用的福尔马林固定石蜡包埋组织切片。

5. 数据收集模式：期望建立自动化的机器人系统，以实现批量组织样本的自动管理、数据采集和质量控制。

6. 同位异构体离子的区分和可靠鉴定：离子迁移质谱（IMS）提供了克服 MSI 在区分同位异构体离子上的限制的可能方向。

7. 功能成像：MSI 获取的质谱数据不仅是一系列分离的峰，这些峰之间存在生物学联系，可以提供关于药物-表型相互作用的见解。

8. 人工智能：深度学习已经被引入到学习分子分布模式和指导精确空间识别中，期望引入更多尖端的数据科学技术和计算方法。

9. 空间组学数据库或平台的开放获取：应该提出并鼓励 MSI 研究人员自由探索和交流的开放获取 MSI 数据平台。