先天性脑积水(Congenital hydrocephalus,CH)也称婴儿脑积水,是一种常见的神经系统疾病,每1000名新生儿中就有约1人患有CH。CH早期对智力无影响,晚期可能会出现表情呆滞、智力迟钝、视力减退和肢体瘫痪,甚至发生并发症而死亡。CH可通过神经外科分流进行治疗,但手术存在较大风险及并发症。因此研究CH的发病机制,开发新的CH预防、诊断和治疗方法显得至关重要。
已有研究证明神经分化不平衡是CH发生的主要原因。基于多种模式生物的遗传学研究,发现在胚胎和神经干细胞中大量表达Trim71,一种保守的、干细胞特异的、RNA结合蛋白(RBP),对早期胚胎发生一定的神经分化密切相关。Trim71的RNA结合结构域内有多个CH作用的突变位点,可以改变Trim71的RNA结合能力,然而,这种突变如何导致干细胞分化缺陷和神经形成缺陷的分子机制仍不完全清楚。
来自梅奥诊所的Qiuying Liu等人,针对Trim71中两个CH相关突变——R595H-Trim71和R783H-Trim71进行了研究,相关研究成果以“Different congenital hydrocephalus – associated mutations in Trim71 impair stem cell differentiation via distinct gain-of-function mechanisms”为题,发表在PLOS Biology上。
因为Trim71突变体引起的CH发病机制在小鼠和人类之间是保守的,因此作者使用小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells ,mESCs)为模型,来研究Trim71中CH相关突变的分子机制。作者通过基因敲除和基因编辑技术,在Trim71中引入R595H或R783H,获得四个突变mESC系,分别代表单等位基因(R595H/+,R783H/+)和双等位基因突变(R595H,R783H),然后采用蛋白免疫印迹杂交(Western Blot)、免疫荧光,CLIP-seq, RNA-seq等手段,与野生型mESCs进行一系列的比较分析。结果发现尽管跟之前的报道一样,Trim71中的CH相关突变R595H和R783H加速了mESCs的分化,增强了神经细胞系的定型,减少了与野生型Trim71靶向mRNA的结合。然而每个Trim71突变体都结合不同的异位靶mRNAs亚群。R595H-Trim71与编码β-连环蛋白的信使核糖核酸结合,并抑制其翻译。增加β-连环蛋白水平可减轻R595H-Trim71 mESCs的分化缺陷,但不能减轻R783H-mESCs中的分化缺陷。这些结果意味着Trim71的RNA结合结构域的功能发生突变,通过不同的病理机制引起CH,CH患者可以根据这些不同的机制进行分层,针对遗传多样的CH病因设计精确的治疗策略。
文中所有的蛋白免疫印迹杂交(Western Blot)操作,均通过美国Precision Biosystems公司提供的全自动蛋白质印迹杂交系统Blotcycler完成。
部分结果展示:
图1. 神经谱系标记在定向神经分化过程中(不同天数)的蛋白质印迹
Sox1和Pax6是神经外胚层特异性所必需的两种谱系特异性转录因子,与野生型mESCs相比,在两种Trim71突变体mESCs的定向神经分化过程中表现出更高的表达(图1 红框)
图2. WT mESC、R595H-mESC和R783H- mESC的蛋白质印迹
R595H-Trim71 mESCs特异性显示β-连环蛋白水平降低,而Ctnnb1 mRNA水平没有变化(图2红框)。
图3. 在WT mESCs中表达空载体、Flag-Trim71、Flag-Trim71(R595H)和Flag-Trim71(R783H)的蛋白质印迹
R595H-Trim71在WT mESCs中的异位表达降低了β-连环蛋白水平,而没有降低Ctnnb1mRNA水平(图3红框)。
来自美国Precision Biosystems公司的Blotcycler,是一款全自动的蛋白质印迹杂交系统,Western Blot洗液工作站,可自动化完成封闭、孵育、清洗和一抗回收的一系列工作,很好地解放您的双手。更为重要和有意义的是:专利的流体清洗可以减少二抗在膜上的附着,降低背景,提高信噪比和灵敏度;自动化的操作流程避免了手工操作带来的误差,保证了批次内和批次间实验的高度重复性;高通量操作和多条件的设定可以辅助您优化Western Blot 实验的条件,例如合适的抗体浓度等,开放的实验平台,无需其他额外投入。Blotcycler是从事Western Blot实验的科研工作者的最佳选择。
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https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001947
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