Western Blotting(WB)蛋白质免疫印迹杂交,是采用印迹技术将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白质转移到膜上,再根据抗原-抗体特异性反应,即一抗/二抗复合物特异性检测复杂样品中某种蛋白的方法(流程如图1)。WB是最常用的蛋白质分析技术之一,广泛应用于蛋白表达水平的检测。
图1:Western blotting实验流程
WB实验过程长,步骤多,结果严重依赖操作者的经验积累和细节把控。为了获得稳定、可靠和可重复的结果,必须优化WB流程的所有步骤。美国Precision Biosystems推出的全自动蛋白质免疫印迹杂交系统Blotcycler,将传统的手工过程自动化处理,极大降低了人为因素的干扰,提高了结果的重复性。在诸多环节中,温度选择同样重要。一抗孵育条件有4℃过夜,室温或37℃下1-2小时(h)几种,其中4℃过夜效果最佳。因此在手工操作流程中,考虑到实际操作的便利和可行性,实验者会采用全程室温,或者一抗4℃过夜孵育其余封闭、二抗孵育和洗膜均在室温下进行。通过对比实验发现,与全程室温或只有一抗4℃孵育相比,多数情况下全程(包括封闭,一抗孵育,二抗孵育和洗膜)4℃,可获取到更好的结果。
洗膜过程在4℃下进行,可以避免特异性抗体-抗原结合的过度解离,同时有效减少非特异性结合,提高结果质量。实验者采用透明细胞肾癌(ccRCC)细胞系的细胞提取物与兔多克隆抗PARP抗体进行WB实验。在完全一致的电泳转膜后,将a膜进行手工封闭孵育和洗膜操作,一抗4℃下过夜孵育,其余步骤均在室温下完成,b膜采用Blotcycler全程4℃下自动化处理,其结果如图2所示:采用手工程序处理的印迹膜,结果检测到多个非特异性条带,见图2a;而Blotcycler全程4℃下自动化处理的印迹膜,仅检测到未切割的PARP蛋白(113kD)以及C端和N端切割的PARP片段(分别为89kD和24kD)的条带,见图2b(数据来自Precision Biosystems)。
图2: a,所有步骤(封闭,孵育,洗膜)均手工操作,一抗孵育4度过夜,其余步骤均室温;b,所有步骤(封闭,孵育,洗膜)均在4度,Blotcycler自动化处理
另外,全程4℃下进行,可以有效提高信噪比和相对灵敏度。实验者采用HeLa细胞的全细胞裂解液和h-IL2进行多重荧光WB平行对比,在完全一致的电泳转膜后,将a、b两张膜分别在室温和4℃下Blotcycler自动化处理。其结果如图3,对两张膜进行荧光强度归一化处理后发现,全程4℃处理的b膜具有更高的信噪比和更好的相对灵敏度,如图3c(数据来自Rockland Immunochemicals, Inc)。
图3: a,所有步骤(封闭,孵育,洗膜)均在室温下进行;b,所有步骤(封闭,孵育,洗膜)均在4度下进行;a和b中,泳道1为marker,泳道2为HeLa细胞的全细胞裂解液,泳道3为重组h-IL2,泳道4为HeLa细胞全细胞裂解液和重组h-IL2的混合样本;c,用MW标准对两张膜进行荧光强度归一化处理后的结果;
从以上数据可以看出,Blotcycler全自动蛋白质免疫印迹杂交系统不仅能避免人为误差,提高结果的重复性,也可以通过优化封闭、洗膜的温度条件,消除非特异条带,提高相对灵敏度,产出高质量的结果
来自美国Precision Biosystems公司的Blotcycler,是一款全自动的蛋白质印迹杂交系统,Western Blot洗液工作站,可整机置于4度环境,自动化完成封闭、孵育、清洗和一抗回收的一系列工作,彻底解放您的双手。专利的流体清洗减少二抗在膜上的附着,降低背景,提高信噪比和灵敏度;自动化的操作流程避免了手工操作带来的误差,保证了批次内和批次间实验的高度重复性;高通量操作和多条件的设定可以辅助您优化Western Blot 实验的条件;开放的实验平台,无需其他额外投入。Blotcycler是从事Western Blot实验的科研工作者最佳选择。
环亚生物,生命科学产品全国性代理商,不断把国外顶级的创新产品引入中国。环亚生物具备完善的公司运营、产品管理、营销、售前技术支持和售后维修体系。环亚生物作为Precision Biosystems产品大中华区独家代理商,负责Blotcycler在大中华区的营销和售后支持。
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