【Nature Nanotechnology】Single-molecule mechanical fingerprinting with DNA nanoswitch calipers
借助DNA纳米开关卡尺绘制单分子蛋白组学的机制“指纹”
从微量或痕量样本中鉴定生物分子是生物技术领域的一个长期目标。近些年,测序技术的迅速发展大大促进了DNA分析对基础研究和临床实践的推动。在蛋白质层面,其结构、功能相对复杂及无法实现体外扩增,尽管质谱法和质谱流式细胞技术等方法取得了一定进展,但是单分子蛋白质鉴定仍然面临挑战 。为此,来自哈佛大学威斯研究所(Wyss Institute at Harvard University)、哈佛医学院布拉瓦特尼克研究所(Blavatnik Institute at Harvard Medical School)和波士顿儿童医院(Boston Children 's Hospital)的科研人员,将DNA纳米技术与单分子力谱相结合,构建了一种DNA纳米开关卡尺(DNA Nanoswitch Caliper ,DNC),能够以原子分辨率测量单分子蛋白上的多个坐标。基于光镊技术,可以进行DNA和肽的绝对距离测量,精度可达埃米级。同时使用多重磁镊子,进行混合蛋白样本中相对丰度的量化检测。研究小组通过测量DNA标记残基之间的距离,对合成肽和天然肽进行了单分子指纹分析,并在异质群体中发现了不同蛋白修饰之间的区别。DNA纳米开关卡尺是一种功能强大且易于使用的工具,将在单分子蛋白质组学等领域实现新的应用。
期刊:Nature Nanotechnology
发表年份:2021年
样本:pET-26b (+) 质粒
应用:PCR产物纯化
图1. DNA纳米开关卡尺(DNC)绘制单分子指纹图谱示意图
DNA纳米开关卡尺(DNC)衍生于DNA纳米开关技术,其本质是一条DNA单链。在DNA单链上存在多个分子 “手柄”。当这些手柄中的两个相互结合时,会在DNA单链中形成闭环,且链的总长度缩短。当施加力量将手柄拉开时,DNA单链就会延伸恢复其原来的长度。链在开环和闭环状态下的长度差异反映了环的大小,进而反映了手柄之间的距离(图1)。在此基础上,通过将手柄设计成可以与生物大分子结合的单链,进而将该技术推进至生物大分子检测。手柄可以有效地将分子“夹在”中间,类似游标卡尺,通过测量DNA纳米开关在开环和闭环状态下的总长度差异,有效地测量生物大分子的大小,形成独特的分子指纹。
其中,DNA纳米开关卡尺是通过连接两个修饰的DNA构建体而产生的(图2)。一种DNA构建体由pET-26b(+)质粒的2820bp区域PCR扩增制备,另一种由环状寡核苷酸、5’-地高辛修饰的寡核苷酸(DNC1)和其他链(DNC2和DNC3),进行退火制备。在构建完成后,使用Blue Pippin全自动DNA电泳回收仪进行目标片段(约3kb)的精准回收,获得单一目标DNA纳米开关卡尺(DNC),无杂带,确保后续DNC指纹功能的正常发挥。
图2. DNA纳米开关卡尺(DNC)构建流程图
文中首先在单链DNA(ssDNA)分子上测试了DNC技术,证实DNC的开环和闭环状态之间的距离变化与目标分子的长度直接相关。这些长度变化可以用埃米级精度(比DNA双螺旋的宽度小10倍)来测量,从而能够识别小到一个核苷酸的长度变化。继而将研究重点转移到蛋白质上,通过已知序列的合成肽,发现手柄之间的距离都与肽中氨基酸长度的预期距离相匹配。同时检测一种名称为NOXA BH3的天然线性化肽时,也得到了类似的结果。更进一步研究表明,通过用一个磁镊子系统取代光学珠,能够对多个不同的肽进行平行测量,并确定不同分子的相对浓度。DNC提供了一种强大的方法用于表征纳米级复合物中的距离和几何形状,对蛋白质组学、纳米技术、结构生物学和药物发现等多个领域有很大的应用潜力。
原文
Shrestha, Prakash, et al. "Single-molecule mechanical fingerprinting with DNA nanoswitch calipers." Nature nanotechnology 16.12 (2021): 1362-1370.
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