从终止反应后2分钟开始，样本的吸光度值逐渐下降，ELISA试剂盒起始吸光度值越高其下降速度越快，为保证实验结果的稳定性，宜在终止反应后2分钟内读取吸光度值。
酶标仪应采用双波长进行测定，必须包括对颜色产物敏感和不敏感的两个吸收峰波长，在非敏感波长处测定特异性显色的吸光度值接近为零，此时测的吸光度值为容器上的划痕、指印、背景等造成的光干扰。以TMB底物为例，其最大吸收的波长为450nm，非敏感波长为630nm，双波长检测最终得到的吸光度值为两者之差。双波长测定能去除背景的干扰，一般不设空白孔，否则会出现吸光度值为负值的现象。
酶标仪的使用需强调仪器的维护和保养，酶标仪首先应放置通风处，避免机器内部尤其是滤光片发霉，在使用过程中避免酸等物质溢出腐蚀仪器，每半年或一年请计量局对酶标仪进行检定，并请厂商定期维护。比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体。酶标仪在使用前应先预热15～30分钟，测读结果会更稳定。五、灰区的设置
通常情况下，ELISA试剂盒定性实验以“阳性”和“阴性”来报告结果，两者间有一条分界线被称为“阳性判断值”（cut-off value，CO值），这是定性免疫测定结果报告的依据。由于ELISA CO值的设置不能区分所有正常和异常的人群，尤其是位于CO值附近的人群，并且ELISA检测具有以下几个特点：检测变异大（18%～65%）；不同试剂盒CO值存在差异；病毒感染存在窗口期；病毒变异后表达产物含量低以及个体差异等，因此在CO值附近存在一个临床意义可疑的的区域被称之为“灰区”，在国内的传染性病原体抗原和抗体检测的ELISA试剂盒中均未涉及“灰区”的设置，但仅仅依靠CO值来决定感染的有无，尤其是对献血员。因此对于检测结果位于“灰区”的病人可采用确认实验或追踪检测的办法加以确诊。
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