宿主细胞使用的技术梳理

宿主细胞使用的技术梳理

摘要：从妥妥的技术角度深度讲解CHOZN^® GS^-/-系统使用过程中的关键点

Step1: 宿主细胞选择中的难点

Step2: 宿主细胞使用的技术梳理

Step3: 培养基优化能不能加胰岛素等物质？

Step4: 如何在控制风险的基础上优化培养基？

Step 5 如何通过过程控制保障产品质量？

Step 6 走进MLab

Step 7 上游生产阶段如何审计培养基质量

Step 8 走进南通培养基工厂

上一期小默介绍了野生型CHO细胞和缺陷型CHO细胞各自的优劣以及如何进行选择的问题，同样，在挑选完宿主细胞后的宿主细胞使用过程中也充满了重重险阻。小默将大家在这部分遇到的问题分为了质粒、转染、筛选、克隆成像、培养基、稳定性、工艺和宿主细胞8大类一一解答：

关于质粒

小明：上次提到UCOE®质粒可以用更少资源获得更多高产克隆，我非常感兴趣，但UCOE®质粒的提取其实是很多企业没有接触，这其中需要注意什么呢？

小默：首先，UCOE®质粒提取所需的感受态细胞类型，建议使用Stbl2或Stbl 3系列的感受态细胞，我们国内MLabTM实验室多次测试过是可行的。除了选择合适的感受态细胞，同时建议低温转化和培养，推荐温度是30℃。转化后需孵育1小时再涂板，平皿培养在30℃培养，培养时间不超过24小时。

具体数据请参考，点击下方链接

CHOZN®&UCOE®组合平台 SAFC®工艺解决方案

小明: CHOZN® GS-/- 配套质粒是环状，那质粒到底是线性化好还是环状更好呢？

小默：理论上，线性化利于整合，环状利于进入细胞，哪个效率更高并不能准确判断。因此建议在自己平台的基础上，选择表现较好的类型即可。而默克的CHOZN® GS-/-平台小默强烈推荐直接使用环状质粒进行转染，CHOZN® GS-/-在转染时并不注重转染效率的小幅提高，因为CHOZN® GS-/-本身可以在不添加MSX筛选压力的条件下进行minipool筛选，恢复率很高接近100%。而且CHOZN® GS-/-平台的优势就是便于客户使用，线性化质粒增加了操作的复杂性。

关于转染

小明：当遇到转染后24 h细胞活率很低，只有30-40%，甚至更低的时候怎么办？

小默：首先要保证转染用的质粒浓度高于1 mg/ml，内毒素含量低于10 EU/ml。另外建议电转实验设计一个阴性对照(ddH2O)，确保电转体系没有问题，通常阴性对照在电转后以及电转后24小时活率均在90%以上，细胞密度也会增长。如果确定转染体系没有问题，可以尝试减少加入的质粒量，优化电转条件。

小明：那CHOZN® GS-/-平台转染后的操作流程是什么样的？以及为什么minipool几乎全部生长出来了，会不会没有筛选效果？

小默：CHOZN® GS-/-转染后静置培养24h后以5000 cells/孔进行minipool铺板，铺板数量6~8块，基本每个孔都能逐渐长满。铺板培养基是80%cloning medium+20%CD Fusion，后续补液及逐级放大都是使用CD Fusion培养基，一般2-3周左右细胞可以达到80%汇合度。

该工艺是优化后的工艺，选择这一工艺是希望用较少的孔板拿到高产的minipool，在保证筛选通量的同时也可以减少工作量。值得注意的是，CHOZN® GS-/-细胞在整个筛选过程中是不需要加MSX的，所以筛选流程与其他宿主细胞不太相同。

小明：那如果使用CHOZN® CHO K1进行细胞株开发，需要加MSX吗？

小默：CHOZN® CHO K1minipool铺板时需要添加MSX，使用浓度建议10uM-30μM之间，后续及单克隆筛选不再需要添加MSX。

关于筛选

小明：接下来如果用CHOZN® GS-/-筛选出来的minipool进行有限稀释，一般按什么密度去铺板？平均一块96孔板大概形成多少克隆？

小默：有限稀释一般常用0.3-0.5 cell/孔的密度铺板，现在很多企业都有成像系统仪器，可以结合成像系统的图像去确定单克隆。MLabTM实验室常用0.5 cell/孔的密度进行有限稀释，不同的minipool会有不同的克隆形成率，平均一块96孔板会形成10-30个克隆。

小明：在CHOZN® GS-/- 平台minipool或克隆阶段，96孔板中的minipool或克隆为什么要传代然后再做7天静置培养，然后根据7天静置培养结果去筛选克隆？

小默：在minipool或克隆阶段，96孔板中的minipool或克隆传代，可以平衡各个minipool或克隆的生长，如果孔板中的细胞较少，可以传代时多保留一些细胞。这样就相当于在细胞接种密度相对平衡的条件下，进行7天静置培养，以此来评估产量，然后再根据产量去筛选，这样筛选更加合理。

小明：在我们挑选克隆时产物质量是否重要？是否有必要重视乳酸产生及糖耗情况，便于后续细胞放大培养？

小默：细胞克隆筛选前期通量较大时，我们可以不用将考察的因素放那么广，前期应以产量和质量为主，类似药以质量为主。在克隆筛选后期，多个克隆进入备选，并且通过稳定性的测试以后，我们会进一步考察生长和代谢相关的指标，比如乳酸产生、耗糖量及Qp等，一般考察备选克隆的这些因素时会在小试生物反应器中进行。

关于克隆成像

小明：在我们进行有限稀释后是否可以离心拍照？单克隆成像仪拍照的细胞飘移现象怎么解决？如果成像图片背景不太干净，是否会影响药物IND申报？

小默：有限稀释后，如果时间允许，考虑静置2-3小时再成像拍照，如果时间不充裕，可以离心后成像拍照，注意要清洁一下离心机的孔板架，防止灰尘等吸附至孔板底部，影响成像图片质量。

单克隆成像仪拍照的细胞飘移现象是行业内普遍关注的问题。时间允许我们建议在单克隆铺板之后静置4小时之后放入仪器中进行拍照，这个时间足够细胞沉到孔板的底部，这样细胞不易产生移动。当然，即便这样操作可能还会出现这样的问题，那我们尽可能选择近距离的缓慢移动。

进行候选克隆筛选时，尽可能选择没有争议，溯源清晰的克隆，假如恰巧候选克隆成像图片背景不太干净，可以将杂质标记出来做好说明，证据一定要充分。

关于培养基

小明：使用CHOZN® GS-/-细胞时从EX-CELL® CD CHO Fusion转换到EX-CELL® Advanced CHO Fed-batch Medium中，需要很长的适应时间吗？细胞生长怎么样？

小默：这个问题可以从两个细胞阶段性的实验来解释，一个是培养基转变进行Fed-batch去评价产量，这个过程是不需要额外进行培养基驯化，可以直接转换去评估；另一个是培养基转变进行细胞传代，从MLabTM实验室的数据看，一般都不需要很长的适应过程，有的细胞转换培养基细胞生长并不受影响，有的细胞转换培养基后，与EX-CELL® CD CHO Fusion传代细胞相比，细胞生长稍慢一些，但传代2-3次后细胞生长就恢复正常了。

关于稳定性

小明：CHOZN® GS-/-平台筛选出来的细胞株稳定性怎么样？一般稳定性研究会做到PDL多少？

小默：默克美国研发实验做的稳定性结果显示，10个候选克隆连续传代10周，PDL大约为65，8个候选克隆最终的产量与最初的产量相比，产量维持在75%以上，其中稳定的克隆中有5个最终产量与最初产量相比，产量维持在90%以上。现在一般稳定性研究会做到PDL60，但是最合适的方法是根据项目实际工艺需求，推算出应该进行至PDL多少。如果PDL60能够满足项目最终商业化生产的要求，稳定性研究做到PDL60即可；如果PDL60不能够满足项目最终商业化生产的要求，稳定性研究就需要做到更高的PDL。

关于工艺                     

小明：14天Fed-batch培养，除了使用说明书上推荐的培养基和Feed，你们会尝试其他的培养基和Feed组合吗？

小默：在minipool和克隆筛选阶段，14天Fed-batch选择说明书上推荐的EX-CELL® Advanced CHO Fed-batch Medium和EX-CELL® Advanced CHO Feed 1即可。待筛选到合适的候选minipool或克隆，会尝试不同的培养基和Feed进行一些早期的工艺开发，例如浓缩和混合等优化补料方案。

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关于建库

小明：宿主细胞是否需要在GMP条件下建二级或三级库？

小默：从目前的法规，并未明确宿主细胞一定要在GMP条件下建二级或三级库，但是细胞出入库记录必须完整准确。如果有GMP条件可以建二级或三级库，推荐建二级或三级库。

CHOZN® GS-/-自推向市场已来，已覆盖全球超100+企业，目前以CHOZN® GS-/-作为宿主细胞的30+项目已经在全球多个国家推进到临床实验和商业化生产阶段。众多的参考案例进一步避免了企业在国内外申报进程中的挑战。

本地化支持助力工艺供应双升级

CHOZN®细胞平台通过上海的MLabTM为企业提供售前培训、技术支持等一系列本地化服务，让企业不再为售后问题发愁；同时， CHOZN® GS-/-平台的培养基已通过南通工厂实现本地化供应，为企业提供稳定的货源、更短的货期，致力于为企业提供最优质的产品和服务，为企业的生产工艺保驾护航。