方案摘要
方案下载应用领域 | 医疗/卫生 |
检测样本 | 全血/血清/血浆 |
检测项目 | 生化检验>元素含量 |
参考标准 | / |
目前发现的金属元素有80余种,人体中含有60余种,其中占人体总质量0.01%的微量元素有20余种如铁、铜、锌、钴、锰、铬、硒、镍、钼、锡等,虽然在人体内的含量较低,但它们是构成细胞结构必不可少的成分,在人体代谢和生理过程中发挥着重要作用;
目的:采用电感耦合等离子体质谱技术,测定血清中21种元素含量,重点优化血清中多元素测定的样品前处理方法。
方法:采用1%硝酸,1% TtitonX-100,0.01%吡咯二硫代氨基甲酸铵与1%乙醇混合溶剂稀释血清样品20倍后,进入ICP-MS 仪器检测 Mn、Co、Ni、Cd、La、Ce、W、Hg、Tl、Mo、Sb、Fe、Cu、Zn、Se、Al、As、Sr、Pb、Sn 和 Cr 21 种元素的含量。
结果:血清中21种元素在线性范围内线性良好(r>0.995);检出限为0.14~15.90 μg/L。方法用于孕妇血清样本检测,低高浓度2个水平的血清加标回收率为82.2%~121.5%,相对标准偏差小于10%。采集639名孕妇血清样本进行检测,21种元素中除Tl、W、La、Ce、Hg ,其余元素均有检出。
结论:通过条件优化,采用混合溶剂稀释法联合ICP-MS对血清中21种金属元素分析,方法快速、简便、准确,适宜用于评估人体元素暴露水平。
目前发现的金属元素有80余种,人体中含有60余种,其中占人体总质量0.01%的微量元素有20余种如铁、铜、锌、钴、锰、铬、硒、镍、钼、锡等,虽然在人体内的含量较低,但它们是构成细胞结构必不可少的成分,在人体代谢和生理过程中发挥着重要作用;还有一些重金属元素不是生命活动所必须,且超过一定浓度都对人体有毒如镉、铅、砷、汞等。人体可通过食品、饮水、空气等摄入元素,为了准确高效的监测人体元素暴露水平,评估其健康效应,建立血清中多元素同时分析方法是必要的。
虽然目前多元素检测的方法已较成熟,在常用的原子吸收分光光度法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法和电感耦合等 离子体质谱法(inductively coupled plasma-mass spectrometry,ICP-MS)中,ICP-MS法的宽线性范 围、高灵敏度和强抗干扰能力,使其在多元素分析 中具有不可比拟的优势,应用范围越来越广,尤其 在生物样品检测中,ICP炬焰的超高温,使得样品经 简单处理也能获得满意的效果。不同的元素在体内的存在形态不同,溶出所需条件亦有差异,虽 已有 ICP-MS 测定血清元素的诸多报道,但笔者在 实验中发现,样品前处理的不同会带来极大的影 响,要兼顾各元素分析,获得灵敏准确的结果尚属不易。因此本文通过重点优化血清样品前处理条件,选择21种常见金属元素进行ICP-MS分析,构 建出一种快速、准确的检测方式,并用于孕妇血清样品的批量分析。
材料与方法
材料: 样品来源于临床检验样品,血样采集后进行血清分离,将血清分装并放入冻存盒中,于-80 ℃冰箱保存。
仪器: 电感耦合等离子体质谱仪(上海美析仪器有限公司)
标准品和试剂:购自国家有色金属及电子材料分析测试中心的21种待测元素标准溶液55 Mn、59 Co、60 Ni、111 Cd、139 La、140 Ce、182 W、201 Hg、204 Tl、96 Mo、122 Sb、56 Fe、64 Cu、66 Zn、78 Se、27 Al、75 As、88 Sr、208 Pb、118 Sn和52 Cr,浓度1000 μg/mL。
5种内标元素标准溶液:45 Sc、72 Ge、115 In、159 Tb和209 Bi,自国家有色金属及电子材料分析测试中心购入,浓度为1 000 μg/mL。
硝酸(BV-III 级),购自北京化学试剂研究所。Triton X-100(LR级),购自Sigma-Aldrich公司。乙醇和四甲基氢氧化铵均为分析纯。
实验方法
ICP-MS仪器条件:通过自动调谐和优化,确定ICP-MS 条件为:射频功率1550W,载气流速 1.05 L/min,采样深度 8.0 mm,雾化器泵速 0.10 rps, 雾化室温度2 ℃,提取透镜-200.0 V;四级杆偏转电 压-3.0 V;八级杆射频功率150 V,能量歧视5.0 V。 各元素均选择He模式进行测定,八级杆碰撞池He 气流速1.0 L/min。
样品稀释剂配制:实验采用1%硝酸(BV Ⅲ级)溶液,1%TtitonX-100 溶液,0.01%吡咯烷二硫 代氨基甲酸铵与 1%乙醇混合作为样品稀释剂。 具体配制方法:以配制 1 000 mL稀释剂为例,加入 硝酸 10 mL,曲拉通 X-100 0.5g,吡咯烷二硫代氨 基甲酸铵 0.10g,乙醇10mL,用纯水溶解并定容至1000mL,充分混匀后置4 ℃保存。
标准溶液配制和标准曲线制定 参考21种 元素在血清中的浓度,分为3个浓度系列配制标准 应用液,其中Mn、Co、Ni、Cd、La、Ce、W、Hg、Tl、Mo 和Sb为同一系列浓度,元素应用液浓度为40 μg/L; As、Sr、Pb、Sn、Cr为同一系列浓度,元素应用液浓度 为100μg/L;Fe、Cu、Zn、Se和Al为同一系列浓度,元素应用液浓度为1000μg/L。分别吸取混合标准应用液 0μL、50μL、100μL、200μL、500μL、1 000μL,定容至10mL,配制成标准系列浓度:Mn、Co、Ni、Cd、La、Ce、W、Hg、Tl、Mo 和 Sb 标准系列浓度为 0μg/L、0.20μg/L、0.40μg/L、0.80μg/L、2.00μg/L、4.00μg/L;As、Sr、Pb、Sn和Cr标准系列浓度为0μg/L、0.50μg/L、1.00μg/L、2.00μg/L、5.00μg/L、10.00μg/L;Fe、Cu、Zn、Se 和 Al 标准系列浓度为0μg/L、5.00μg/L、10.00μg/L、20.00μg/L、50.00μg/L、100.00μg/L。
将上述标准系列溶液注入ICP-MS中进行分 析,以各待测元素浓度为横坐标,各待测元素与相应内标元素的响应值比值为纵坐标,绘制标准曲线。选择与待测元素原子量接近的内标进行相应的校正。
方法学验证 从灵敏度(检出限)、精密度(相 对标准偏差)和准确度(回收率)3方面进行方法学 验证,以考察方法性能,数据分析通过 Excel 2007 进行计算。通过平行测定混合血清10次,以测定值 的 3 倍和 10 倍标准差对应的浓度计算检出限 (LODs)和定量限(LOQs);吸取混合血清样品9份, 其中 3 份用于测定本底值,另取 6 份分别加入定量 限和 2 倍定量限水平的标准溶液,在 1 日内重复测 定6次和6日内重复测定21种元素的含量,计算测 得值的相对标准偏差值(RSDs)和加标回收率。
样品分析 采集血样后分离血清,将血清分装于0.5mL离心管内,编号并放入冻存盒内,-80 ℃冰 箱保存。实验前取出于室温下解冻。吸取100μL血清样品于5mL塑料离心管中,加入稀释剂:1%硝酸 (BV Ⅲ级)溶液,1%TtitonX-100溶液,0.01%吡咯烷 二硫代氨基甲酸铵与1%乙醇直接稀释20倍,涡旋 混匀,10 000 r/min离心2 min,取上清进样分析。质 控血清以同样方式进行处理。
样品分析的质量控制 每批次上机前和每测30个样品后进行质控检测,包括程序空白、平行样和质控样品。程序空白实验是指前处理过程中,除不加样品外,其他步骤同1.3样品分析,用于监测整个实验分析阶段中待测元素的干扰,若在进样液中检出待测元素,则需排除原因后重新测定。平行样指对同一血样进行相同的处理和分析,2次检测结果差值应不超过平均值的10%,否则需排除原因后重新分析。ClinChek微量元素质控样检测,测得值与标准值的相对偏差均在参考值范围内。
ICP-MS 测定模式选择 采用碰撞反应模式(He)和标准模式(No gas)考察了ICP-MS的测定模式,通过加标样品分析,各元素在He模式下的回收率均优于 No gas 模式,回收率在 80%~120%范围内。因此实验选择在He模式下进行测定。
样品前处理方式优化
直接稀释法与微波消解法的比较 ICP-MS测定时常用的样品前处理方式有微波消解法和直接稀释法。消解法对有机物的消解能力强,能更有效降低样品的基质效应,但操作相对繁琐,消解过程中待测元素易受到污染和损失。ICP-MS采用超高温的ICP炬焰,对物质进行离子化的同时,也可使样品基质高温下彻底灰化,因此一些液态样品经过简单的处理如稀释、过滤等,即可引入仪器进行元素测定。实验比较了直接稀释法和微波消解法的加标样品回收率,结果表明采用消解法,Al、Pb等元素空白值偏高(>2.0 μg/L)且相对标准偏差大(15%~30%),并且由于加热赶酸会造成Hg元素损失,回收率偏低(低于70%);直接稀释法的元素回收率均较为理想(高于80%),空白可以得到有效控制。因此,实验选择直接稀释法进行样品处理,并进一步优化了稀释剂组合和稀释倍数。
稀释剂选择 稀释溶剂一般使用水和一定浓度的硝酸,为了提高测定灵敏度,可加入非离子性表面活性剂或有机试剂如曲拉通X-100、乙醇,以及金属络合剂如吡咯烷二硫代氨基甲酸铵,同时防止未溶解的生物蛋白物质堵塞 ICP-MS 雾化系统。与酸性稀释剂相比,碱性稀释剂如四甲基氢氧化铵,可减少酸度对ICP-MS的干扰,又可以快速消除记忆效应。综上,参考美国疾病预防控制中心测定标准(DLS 3016.8. Blood Metals Panel 2 (BMP2)ICP-DRC-MS.)和中国团体标准(T/WSJD 19.1—2021,全血中 23 种元素的电感耦合等离子体质谱法),实验拟采用 1%硝酸溶液、0.05%Triton-100、0.01%吡咯烷二硫代氨基甲酸铵、1.0%,v/v 四甲基氢氧化铵、1%乙醇作为稀释溶剂,并采取以下4 种组合方式进行实验,选取最优稀释剂组合。方法①:四甲基氢氧化铵(1.0%,v/v)+曲拉通 X-100(0.05%)+吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(0.01%)+乙醇(1%,v/v);方法②:曲拉通X-100(0.05%)+吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(0.01%)+乙醇(1%,v/v)(色谱纯为佳)+硝酸(1.0%,v/v);方法③:曲拉通 X100(0.05%)+硝酸(1.0%,v/v)+吡咯烷二硫代氨基 甲酸铵(0.01%);方法④:曲拉通X-100(0.05%)+硝 酸(1.0%,v/v)+乙醇(1%,v/v)。
经过几种组合的比对,实验结果显示,硝酸的加入可以显著提高 Al、Ni 2 种元素的线性,以及Cu、Sn、La、Ce 的回收率(从<60%增至>75%),说明这几种元素在硝酸介质中不易降解或沉淀损失,更易溶出;吡咯烷二硫代氨基甲酸铵加入可以显著提高Sn、La、Ce的回收率(从<40%增至>88%),说明吡咯烷二硫代氨基甲酸铵可提高这几种元素的溶出;乙醇的加入可使得As的回收率好转,且能有效提高大多元素的响应值(1.1~1.5 倍);四甲基氢氧化铵的添加会造成 Al、Cu、La、Ce 等元素回收率下降,可能是碱性条件下容易发生沉淀造成损失,对其余各元素影响甚小。综合各元素回收率的情况,实验最终选取稀释剂组合为:1%硝酸,0.05%TrtionX-100 溶液,0.01%吡咯二硫代氨基甲酸铵,1%乙醇。
稀释倍数 随机抽取10份血清样品混合,优化的稀释剂,在10~30倍范围内对稀释倍数进行了考察。由于血清粘度较大、基质较复杂,采用较低稀释倍数时,容易堵塞进样毛细管,对部分元素尤其是样品中低含量的元素分析产生干扰,使其测定的精密(>20%)和回收率较低(40%~60%),但稀释倍数太高又会导致一些元素分析灵敏度低。综合考虑回收率和灵敏度,实验最终选择血 清样品稀释20倍,离心后进样分析。
讨论
检测模式和样品前处理方式 实验比较了 ICP-MS 在 2 种模式下(He模式/No Gas 模式)各种 元素的测定结果,考虑到元素的线性回归以及加标 回收率,在前者模式下各种元素有更好的结果呈现, 因此实验选择了在He模式下进行元素测定。这基于He模式可以有效消除多原子离子干扰,是ICP-MS测定的基本原理,在此不再赘述。 实验重点考察了血清样品前处理方式,采用 消解法与直接稀释法对血清样品进行前处理。与 文献报道一致,消解法可以彻底的除去血清中的 有机基质,取得良好的回收率,但挥发性元素的挥 发损失、消解后的赶酸过程以及因赶酸不彻底带来的酸度干扰,均会使操作更为繁琐或降低方法的准确度。
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