因为ELISA试剂盒测定中单个空缺孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空缺孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，所以在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。ELISA试剂盒因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的长处。ELISA试剂盒比色结果的表达以往通用光密度（oplical density，OD），现按划定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。
最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。以软板为载体的试验，需先将板置于尺度96孔的座架中，才可进行比色。ELISA试剂盒比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔。
所谓的单波长比色等于通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长双色则酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长630nm下各测定一次，敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变波长至一定值，ELISA试剂盒使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。
以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，ELISA试剂盒而前者比色波长为450nm，后者为492nm，滤光片需根据要求随时更换。
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