µ-Slide 8 Wellhigh(货号:80806)8孔高壁进行免疫荧光染色
免疫荧光(IF)是使用显微镜深入了解细胞结构和过程的有效方法。此方法可评估特定蛋白质的表达和位置,使得免疫荧光成为科学家解决许多细胞生物学问题不可或缺的工具。
下面我们将介绍一种在ibidi µ-Slide 8 Well high 八孔高壁载玻片中培养和免疫荧光染色的贴壁人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的一体化简单便捷的方法:
请注意:在开始细胞免疫荧光实验之前,需要检查几个重要参数,例如目标蛋白质的表达水平、最佳细胞密度以及理想的培养细胞的耗材和基质/涂层。还应评估最佳抗体稀释度。此外,阳性和阴性对照是验证免疫荧光染色的必要条件。因此,我们强烈建议在实验前进行全面的文献研究。
1. 材料
1.1. 试剂和缓冲液:
• 人脐静脉内皮细胞(HUVEC、C-12203、Promocell)
• 胶原蛋白 IV(354233,Corning)
• 0.05M HCl (X942.1, Carl Roth)
• 细胞培养基:内皮细胞基础培养基(C-22210,Promocell)和内皮细胞生长培养基补充混合物(C-39215,Promocell)
• PBS(14190144,Gibco)
• Accutase(A1110501,Gibco)
免疫荧光染色:
• PBS(14190144,Gibco)
• 福尔马林,10%,即用型(HT5011,Sigma Aldrich)
• 单克隆抗 α-微管蛋白(T5168,Sigma Aldrich)
• 抗小鼠 IgG-Atto 594 (76085 Sigma Aldrich)
• 鬼笔环肽 488 偶联物(ab176753,Abcam)
• 使用DAPI 的ibidi 抗荧光淬灭剂(50011,ibidi)
• Triton-X-100(A16046,Thermo Fisher Scientific)
• 穿透缓冲液(PBS 中0.5% Triton-X-100)
• 封闭缓冲液(PBS 中1% BSA + 0.2% Triton X 100)
• 抗体稀释缓冲液(1% BSA + 0.05% Triton X 100 的PBS 溶液)
• 牛血清白蛋白 (BSA) (A1470-10G, Sigma Aldrich)
• ibidi浸油(50101,ibidi)
1.2. 设备:
80806八孔高壁
µ-载玻片架(80003)
• µ-Slide 8 Well high 8孔高壁腔室载玻片,ibiTreat(80806,ibidi)
• µ-载玻片架(80003,ibidi)
• 标准细胞培养设备(移液器、无菌工作台、细胞培养箱、培养瓶、细胞培养基、血细胞计数器等)
• 带有适当滤光片组的倒置荧光显微镜
2. 方法
2.1. 细胞培养:
使用前µ-Slide 8孔高壁腔室载玻片前,请阅读说明书。在无菌条件下执行所有步骤。实验开始前,在标准细胞培养瓶中制备 HUVEC(如T75,用0.05 M HCl包被6.7µg/ml IV胶原蛋白1 小时),细胞贴壁。实验当天细胞应该是健康的并且处于最佳汇合状态。
在整个过程中快速工作很重要,这样孔中才不会干涸。
如果未另行说明,则所有给定的体积都为每孔的体积,所有的孵育步骤都是在室温下进行的。
• 用Accutase处理培养的HUVEC 1-2分钟以进行分离。
• 收集细胞悬液,离心,用少量培养基稀释后进行计数;量取决于所需的细胞浓度。
• 计数细胞,在内皮细胞基础培养基和内皮细胞生长培养基补充混合物中,并调整到最终浓度为 2 x 105cells/ml 。
• 打开 ibidi µ-Slide 8 Well高壁的包装并将其放在µ- Slide Rack或适当的表面上。
• 在每个孔中加入250µl的HUVEC悬浮液。
• 盖上随附的盖子。
• 将载玻片与支架一起放入培养箱(37°C,5% CO2)中,让细胞附着至少3小时或过夜。
• 对于延长细胞培养,我们建议每隔一天更换一次培养基。
2.2. 固定、透化和封闭:
• 为您的实验准备足够的穿透缓冲液和封闭缓冲液。
• 使用细胞培养吸液装置从孔中吸出细胞培养基。
• 用PBS清洗细胞:将200 µl PBS缓慢加入每个孔中并吸出。
• 用200µl福尔马林 (10%) 固定细胞10分钟。
• 去除福尔马林并用200µl PBS洗涤细胞3次。
• 将细胞在200µl穿透缓冲液中孵育10分钟。
• 去除穿透缓冲液并用200μL PBS清洗细胞。
• 用200µl封闭缓冲液封闭30分钟。
2.3.染色和封片:
• 在封闭步骤中,准备足够的抗体稀释缓冲液来稀释一抗和二抗。
• 在抗体稀释缓冲液中稀释一抗(α-微管蛋白:1:200稀释)。
• 将细胞在150µl一抗溶液中孵育 2 小时(请注意,许多抗体需要在4°C下过夜孵育)。
• 用200µl Blocking Buffer清洗两次。
• 在相同的抗体稀释缓冲液中稀释二抗和鬼笔环肽(anti-mouse-IgGAtto 594:1:200 稀释度;鬼笔环肽488偶联物1:1000 稀释度)。
• 在黑暗中将细胞在150 µl的二抗溶液中孵育 2 小时。从此时起,样品应尽可能保存在黑暗中
• 用200 µl Blocking Buffer清洗两次
• 清空所有孔。
• 每孔加入一滴含有DAPI的ibidi封固剂。
• 储存在4°C的黑暗中,直到成像。最好立即进行成像,因为较长的存储期可能会降低图像质量。
2.4.成像:
• 使用适当的滤光片组在荧光显微镜下观察细胞,必要时使用ibidi 浸油。
• 可选,覆盖图像以创建合并图像。
3. 结果
HUVEC 在µ-Slide 8孔高壁腔室载玻片中免疫染色 ,宽视场荧光显微镜。F-肌动蛋白细胞骨架被鬼笔环肽(红色)染色。α-微管蛋白抗体用于染色微管(绿色)。用 DAPI(蓝色)可视化细胞核。该图像是在尼康显微镜上使用具有油浸的 60 倍物镜拍摄的。
如果您的免疫荧光(IF)染色未达到预期效果,您可以在这里(免疫荧光染色故障排除指南)里找到故障排除提示!
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