Ibidi 3孔/8孔/12孔可移除腔室载玻片
免疫荧光实验
ibidi提供了一种简单且经济高效的方案,使用一片可移除的腔室载玻片进行细胞的培养,固定和染色,无需爬片,是倒置/正置显微镜以及长期样品储存的理想选择。
本应用提供了一种使用ibidi8孔可移除腔室载玻片(80841)培养、固定和染色细胞的简单方案。培养MCF-7细胞并用福尔马林溶液固定。细胞核用DAPI染色,肌动蛋白骨架用DYE-490鬼笔肽染色。利用一级和二级抗体染色,通过免疫细胞化学可以探测其他细胞内结构。
实验使用的材料和试剂:
· 8孔可移除腔室载玻片(ibidi,80841)
· 可移除腔室载玻片用的盖玻片,24 x 60 mm(ibidi,10811)
· 细胞:MCF-7(CLS,300273)
· 细胞培养基
· 细胞培养试剂
· PBS缓冲液
· 福尔马林中性缓冲液,10%(Sigma,HT5011)
· 染色试剂
o DAPI(Sigma,D954)
o DYE-490鬼笔环肽(Dynomics,490-33)
· 封片剂:FluoroshieldTM(Sigma,F6182)
实验方案
细胞培养,固定,染色和成像观察--都是在一个开放型小室中搞定:)
步骤1:
必须在预实验中确定细胞系的正确接种浓度。根据您的细胞类型,用4-6x104细胞/ ml在2-3天内产生汇合的单层。
1.在无菌条件下,打开8孔可移除腔室载玻片(ibidi,80841)包装。
2.像往常一样用胰蛋白酶消化并计数细胞。细胞浓度为5×104细胞/ ml MCF-7。
3. 将400微升细胞悬浮液加入腔室的每个孔中。避免摇晃,因为这会导致细胞分布不均匀。
4. 用配套的盖子盖住。在37°C和5%CO2下培养。细胞至少培养24小时,或直到建立融合的单层。
步骤2:
固定是染色程序的第一步。目标是将细胞,细胞形成物或组织维持在其当前状态,并在较长时间内通过化学试剂保存。
1.小心地吸出细胞培养基。
2.用PBS洗两次。
3.加入400μl福尔马林溶液。
4.在室温下孵育30分钟。
5.小心吸入福尔马林溶液。
6.用PBS洗涤三次。
步骤3:
应根据感兴趣的细胞结构选择染色试剂。在该方案中使用DAPI和DYE-490鬼笔环肽染色MCF-7细胞的细胞核和肌动蛋白骨架。
1.准备你的染色溶液:
· PBS
· DYE-490鬼笔环肽
· DAPI 1μg/ml
2.小心吸出PBS。
3.移取400μl染色溶液到每个孔中
4.在室温下避光孵育30分钟
步骤4:
染色后清洗样本可最大限度地减少背景信号
1.小心地吸出染色溶液
2.加入400μl缓冲液
3.小心地吸出缓冲液
4.重复步骤2和步骤3至少一次
步骤5:
从一个边缘开始,用手或用镊子小心地取下硅胶垫圈。该步骤应以缓慢,稳定的进行,以避免损坏细胞层。
步骤6:
完成染色程序后,必须在用显微镜成像之前封固样品。该步骤还可防止样品脱水。
1.将载玻片侧面在干净的实验室湿巾上轻敲,去除样品中多余的介质。
2.将封固剂涂在样品上。用24 x 60毫米的盖玻片覆盖安装好的样品,小心地将盖玻片放到安装介质上,以避免夹住任何气泡。
Tip:建议使用硬化封片剂,如FluoroshieldTM (Sigma-Aldrich), Vectashield? (Vector Laboratories Inc.), or ProLong Antifade? (ThermoFisher Scientific)。
3.等封片剂固定好。
步骤7:显微观察
在可移除8孔腔室载玻片中免疫染色的MCF-7细胞的荧光显微镜检查。绿色:α-微管蛋白,红色:F-肌动蛋白(鬼笔环肽),蓝色:细胞核 (DAPI)。使用20倍物镜拍摄宽场荧光图像。
免疫荧光实验实例
人眼的小梁网细胞,在 ibidi 8 Well Chamber 8孔可移除载玻片中。F-肌动蛋白丝显示为绿色;细胞核被 DAPI(蓝色)染色。图片由中国香港香港理工大学视光学院的Samantha Shan提供。
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