01、实验材料准备
µ-Slide Chemotaxis
02、实验步骤
将HUVEC接种在50%Matrigel®中,并填充至µ-Slide Chemotaxis中,然后将其沿10%FCS梯度迁移24小时。采用免疫染色法观察内皮细胞在Matrigel®中定向迁移后的形态学特征。HUVEC的染色是直接在µ-Slide细胞趋化载玻片中进行的。在染色方案的所有步骤中,将60 µl的相应溶液分别添加到两个大储液池中。在孵育过程中,所有塞子均保持关闭状态,以免干扰通过观察通道的扩散。除非另有说明,否则所有步骤均在室温下进行。
1) 从一边储液池中取出塞子,然后吸出培养基。在抽吸和冲洗步骤中,将塞子留在中央通道中。
2) 用1x PBS洗涤→3x 10分钟
3) 用4%多聚甲醛固定细胞和基质蛋白→1x 40分钟
4) 用1x PBS洗涤→2x 10分钟
5) 用0.2%Triton X-100 / PBS透化细胞→1x 20分钟
6) 用1x PBS洗涤→6x 10分钟
7) 用1% BSA/PBS阻断非特异性抗原→过夜
8) 用1x PBS洗涤→6x 10分钟
9) 添加一抗:单克隆抗VE钙黏着蛋白,小鼠(在1%BSA / PBS中为1:100)→在4°C下1x 24小时
10) 用1x PBS洗涤→6x 10分钟
11) 添加二抗:山羊抗小鼠IgG(H + L),Alexa Fluor 680(在1%BSA / PBS中为1:50)→在4°C过夜
12) 用1x PBS洗涤→6x 10分钟
13) 加入染色混合物→1x 40分钟
i) 罗丹明phalloidin染色肌动蛋白丝(PBS中1:400)
ii) Hoechst 33342对细胞核染色(1:100,PBS中0.5 µg/ml)
14) 用1x PBS洗涤→6x 10分钟
15) 将最后的PBS留在储液罐中并开始成像。
免疫荧光图像由LeicaSP8SMD共聚焦激光扫描显微镜获得,配以63xHCPLAPO1.2NA水物镜。用405nm紫外激光激发Hoechst 33342,594nmHeNe激光激发罗丹明-phalloidin,638nmHeNe激光激发AlexaFluor680。
重要提示:与标准染色方案相比,洗涤和染色步骤所需的培养时间更长。这是为了确保抗体通过凝胶充分扩散。
03、实验结果
HUVEC在Matrigel®基质中的免疫染色显示,相邻的细胞组优先形成细胞簇并作为集合体迁移。少数细胞呈单细胞迁移。
图1:显示HUVEC在50%Matrigel®中的多细胞趋化性的细胞簇。固定后,对细胞进行细胞核(蓝色)、F-肌动蛋白(红色)和VE钙粘蛋白(青色)染色。白色箭头表示VE介导的细胞-细胞接触。
当细胞作为个体迁移时,细胞体被拉长,呈间充质梭形。细胞呈前后极性,前缘呈小片状,向梯度方向有突起。
当以多细胞单元组织时,细胞团簇表现出明显的前后不对称的群极化(图1)。在这里,一个或几个前导细胞参与了前缘的形成,前缘表现出细长的突起或宽的片层。迁移复合体较深区域的连续细胞没有极化。然而,这些细胞特征性地保留了VE钙粘蛋白介导的细胞-细胞接触(图1)。
04、订购信息
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