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新生小鼠(24h内)星形胶质细胞原代培养及冻存由上海劲马实验室提供,欢迎来电咨询其他种属实验过程。 材料:新生小鼠(24h内)一只,75%酒精,小烧杯两个,0.25%胰酶(含有0.3%EDTA),DMEM高糖培养基(10%FBS,4mmol/L谷氨酰胺,100U/ml青霉素,100mg/ml链霉素),D-Hanks,冰块,冰袋,眼科剪3把,中号剪子一把,小号弯镊一把,直头镊两把,眼科镊两把,中号培养皿3个,十五毫升试管3个,小号培养皿一个。 过程: 1、将小鼠头朝下放入盛有碎冰的小烧杯中,当看到尾巴变白时取出,再放入盛有75%酒精的小烧杯中,消毒大约1-2分钟。 2、在一号培养皿中将小鼠断头,去除头皮,马上移到2号皿中,用眼科剪剪开头骨。头骨打开后,用弯头镊子将大脑取出,放到3号皿中,用眼科镊去除大脑表面血管,并将皮质剥离,放到4号皿中。(2号皿,3号皿中预先放好滤纸,并用D-Hanks润湿,4号皿中预先放有500μl D-Hanks,所有培养皿都放在冰袋上)。用眼科镊将4号皿中的皮质剪碎(越碎越好),然后往4号中加入0.25%胰酶500μl。放入37°C孵箱孵育30分钟。 3、30分钟后,用吸管小心的将组织块移到盛有完全培养基(4ml)的1号试管中(移取时要小心,绝对不能吹打)。再将组织块移到盛有完全培养基(4ml)的2号试管中(移取时要小心,绝对不能吹打),在2号管中,进行吹打。吹打结束,静止3分钟左右后,用吸管将未消化的组织块移到有完全培养基(3ml)的3号试管中,同样进行吹打。吹打结束,静止3分钟左右后,用吸管将上清移到2号管中。将2号管中的细胞悬液用孔径75μm的滤网过滤。将过滤后的细胞悬液种植于培养瓶中。 4、种植后第三天换液,以后一周内换两次液 5、第十天,星形胶质细胞大约长满瓶底,移除培养基,再加入2-3ml后,将培养瓶密封好,在气浴摇床上以250rpm,37°C处理15小时。 6、15小时,换液或传代。 冻存: 方法与其他细胞方法相同,只是冻存液组份改为90%的FBS和10%DMSO。
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