感受态的配置及注意事项
感受态是指一种容易接受外源DNA的状态。在转基因的过程中,一般会把待转化的宿主细胞处理成为感受态,以提高转化的效率。受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl2,RuCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。
DH5a菌感受态的制备:
1、从LB平板上挑取DH5a单菌落,接种于3LB液体培养基中 37℃下振荡培养12h左右直至对数生长后期培养基中。
2、将菌悬液以1:100的比例接种于LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜,再将菌悬液以1:100的比例接种于100ml LB液体培养基中37℃,210rpm至OD =0.5左右(生长对数期),约2-3h。
3、将菌液转移到两只预冷的50ml无菌离心管中,冰浴30min,4℃、5000rpm离心5min,弃上清;
4、每只离心管中加入4ml冰冷的0.1M CaCl2,使菌体重悬,冰浴30min,4℃、5000rpm离心5min,弃上清;
5、每只离心管中加入1ml冰冷的0.1M CaCl2,重悬后分装到无菌的1.5ml离心管中(每管100μl);
置-40℃冰箱长期保存;
1、制备感受态的注意事项:
1、所有器具必须清洁干净,避免污染。
2、培养基装量建议不要高于培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml,50ml/250ml,厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。
3、接种前的pH值在6.8-7.2。等菌摇好后,可以测一下pH值,不要低于6.0,最好在6.5以上。
4、经验证明,当培养基中存在一定量的Mg2+离子时,该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时,使用20mM MgCl2做为培养基的添加物,在感受态收获之前20-30分钟加入,会收到很好的效果。
5、较低的温度培养有利于感受态的形成,这样可以获得较高的感受态,但太低又不实用,因而产生了Inoue的高效感受态制备方法。
6、在保存感受态时,DMSO要比甘油的效果要好,它会使感受态的效率增加。
7、液氮速冻也会使感受态的效率提高,因此推荐用液氮速冻感受态,然后保存于超低温冰箱内。
8、冻存的感受态用一次拿一管,不要反复冻融。化冻之后立即使用,不要冰上放太久。
9、操作时可以轻弹轻甩,尽量避免用移液器吹吸。
H9人胚胎干细胞培养方法
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