免疫组化(IHC),此种高端大气的实验自然深得科研者的宠爱,然而做过该试验的人都知道,IHC看似容易,但是其花样百出的问题重视让实验者们精神备受摧残,
其实,想把IHC做好,还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验的。
免疫组化(IHC)常见的8大疑问
1要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片,这是我向一老师请教得出的结论。因为作石蜡切片时要高温烤片,可能会破坏组织的抗原性,如果组织的抗原性较稳定,则可作石蜡切片;但是要求做石蜡切片的,可作冰冻切片。
2.冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性,做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构,可能会使抗原弥散;切片厚度较石蜡的厚,做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时,目录上都写着做什么样的切片,如果它写着只能做冰冻,就不能做石蜡,如写着两者都可,那就都能做。
3.石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构,且容易存放在室温,而冰冻切片比较麻烦,一定要存在-80oC的低温冰箱中,尤其是用来做原位杂交的切片,为了防止RNA降解,保存一贯很重要。于石蜡切片可以切到4μm左右,所以原位杂交探针容易渗透到组织中去,容易成功,而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。
1.单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合,就像导弹精确地命中目标一一样。另一方面,即使是同一个抗原决定簇,在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体,形成好几种单克隆抗体混杂物,称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中,-般单克隆抗体特异性强,但亲和力相对小,检测抗原灵敏度相对就低;而多克隆抗体特异性稍弱,但抗体的亲和力强,灵敏度高,但易出现非特异性染色(可以通过封闭等避免)。
2.应用范围的选择。有的一抗只能用于WB (Westernblotting) 或免疫组化、兔疫荧光、免疫沉淀等;甚至表明石蜡切片或冰冻切片。
3.种属反应性的选择。这一点很重要, 表明这种抗体可能存在种属差异,且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。
4.种属来源, -般兔来源的多是多克隆;而小鼠来源的多是单克隆,但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。
1.TritonX- 100化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚,是-种去污剂。在免疫组织化学(10μm以上厚切片)和免疫细胞化学中一般用TritonX-100作为细胞通透剂, 在膜上打孔。
2.其作用原理: TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内,故在细胞免疫组化时尤为推荐使用,这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
3.TritonX-100既是一种表面活性剂, 也有抗氧化作用。
1.膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体,造成后续结果的假阳性。
2.封闭血清一般是和二 抗同一来源的,血清中动物自身的抗体,预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合,否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合,会造成背景。
3.也可以用小牛血清、BSA、 羊血清等,但不能与-抗来源-致。
1.一 抗孵育温度有几种: 4°C、 室温、37°C, 其中4°C效较好;孵育时间:这与温度、抗
体浓度有关,-般37°C, 1-2h, 而4°C过夜和从冰箱拿出后37°C复温45min。
2.二抗一般室温或37°C, 30min-1h, 具体时间需要摸索。
1.一方面,防止切片从4°C直接放入PBS易脱片。
2.另一方面,使抗原抗体结合更稳定。-般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用, 4°C和
37°C时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。
3.其实,我更赞同后-种说法,因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4°C过夜拿出后,直接用PBS洗没发生过脱片现象。事实胜于雄辩。
1.DAB显色时间不是固定的,主要由显微镜下控制显色时间,到出现浅棕色本底时即可冲洗。
2.DAB显色时间很短(如几秒或几十秒)就出现很深的棕褐色,这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长,需要下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间。
3.若很短时间就出现背景很深,还有可能是你前面的封闭非特异性蛋白不全,需要延长封闭时间。
4.DAB显色时间很长(如超过十几分钟)才出现阳性染色,-方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短(一 抗4oC过夜) ;另一方面就是封闭时间过长。
1.阳性着色细胞计数法。在40倍光镜下,随机选择不重叠的10个视野,人工或机器计数阳性着色细胞,每组3-6张不同动物组织切片,然后进行组间比较即可。
2.灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用imageJ进行灰密度分析,然后进行统计分析即可。
3.评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度(0-3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性范围进行评分(1-4分为0-25%、 26- 50%、51-75%、 76-百分之百) ,最终可以分数相加,再进行比较。
对于以上这几种方法,各有利弊,请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。
免疫组化(IHC)十大实战经验
1、切好的切片放在4摄氏度左右冰箱里,抗原较不容易丧失。把要做的切片先分好,做几个抗体可分几盒,还有不正常组织与正常组织要分开。余做预实验用。
每次开始做时,都必须先清点实验的必需品是否齐全。想好可能发生的意外,并先想好补救措施。
首次预实验先拿出多张不同的组织切片按最常规的条件进行,若没阳性再拿多张不同组织片(可以与首次相同),条件要适当改进,可先找出一个阳性区域,再深入改进。
烤片(单一或综合)程度要适情况而定,可中途拿出甩一甩,尽可能先放在烤箱里烤3小时以上。切勿把片烤得太久了。程度刚好,脱蜡效果才会好。注意做好不同条件的切片标记。注意温度稳定,再烤片。
抗原修复与烤片:温度高低,缓冲系统。
二甲苯脱蜡,若是天气太冷,可先把二甲苯整罐放进烤箱加热,同时也可把片放在二甲苯里一 起加热脱蜡,这样会更彻底,效果会更好,若是天气不会太冷,那还是室温下脱蜡,要不可能会适得反。时间也是适情况而定。
脱水与水化。酒精梯度不同。高低相反。
做的切片量较多时,冲洗擦片顺序很重要,小心PBS与抗体混合。PBS切勿把组织冲洗掉。量少时,孵育盒内先倒点水,防止孵育箱内抗体被蒸发掉。
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