在PCR实验中使用适当的聚合酶将确保较佳的产量和特异性,但市场上有那么多种聚合酶,如何选择,有时还真是个难题。厂家一般都会提供一个选择指南,列出每个产品的特异性、保真度、产量等。保真度是实验成功最关键的因素之一,不可不重视。
什么是聚合酶保真度?
DNA聚合酶的保真度是指准确复制目的模板的结果。具体来说,这涉及到多个步骤,包括读取模板链,选择正确的三磷酸核苷,并将此核苷酸插入3’引物末端的能力。为了高效区分正确和错误的核苷酸,一些DNA聚合酶具有3’到5’核酸外切酶活性。这种“校正”活性可切除不正确掺入的单核苷酸,并将其替换成正确的核苷酸。高保真PCR使用掺入错误率低且具有校正活性的DNA聚合酶,以保证目的DNA的忠实复制。
保真度在何时很重要?
在设计PCR实验时,你首先要考虑你的应用是否需要高保真聚合酶。如果实验结果依赖于正确的DNA序列(如克隆或测序),那么你就要尽量减少错配核苷酸的掺入。而对于普通PCR或菌落PCR,确定扩增子是否存在或质粒上是否带有插入片段,那高保真则大可不必。由于某些高保真聚合酶的强劲特性,一些研究人员在所有扩增中都使用它们。
如何测定保真度?
厂家通过各种不同的方法来确定DNA聚合酶的保真度。Thomas Kunkel曾介绍过一种方法,使用M13噬菌体的部分lacZα基因,通过宿主菌落颜色的变化来检查DNA合成中的错误。以Kunkel的分析为基础,Wayne Barnes则开发出一种分析,利用PCR来复制整个lacZ基因和两个抗药性基因的一部分,随后连接、克隆、转化和蓝白斑筛选。若lacZ基因存在错误,则破坏β-半乳糖苷酶活性,导致白斑的出现。通过这些实验方法,白斑克隆的比例可转化为错误掺入的数量。Sanger测序则提供了保真度的更直接读取,可检测所有突变。利用这种方法可确定聚合酶的整个突变谱。
何为高保真?
关于DNA聚合酶的高保真,目前还没有统一的定义。人们往往与Taq DNA聚合酶比较,来判断保真度的相对高低。例如,NEB(New England Biolabs)的科学家测定Taq聚合酶的错误率为2.7x10-4 ± 0.8x10-4,或每3700个碱基1个错误。这些数据表明,利用Taq以25个PCR循环扩增400 bp的片段,可能一半的克隆都带有错误。对于较大的片段如1 kb,每个克隆都可能带有不想要的突变。相比之下,NEB的Q5超保真聚合酶的错误率比Taq低100倍。根据这一数据,200个克隆中的199个将是正确的。
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