EPR应用 | 探究饮食中硝酸盐对人体的作用

锘海生物科学仪器（上海）有限公司

2019/09/10 13:33

硝酸盐和亚硝酸盐这两个名词大家应该不陌生，它可能会让你想到高中化学课或是肥料，但你可能不太会把它们与你的食物联系起来。如果你确实想到食物中的（亚）硝酸盐，很可能会想到一个负面的形象——特别是因为可能潜在的致癌作用而受到严格管控的硝酸盐和亚硝酸盐防腐剂。

“硝酸盐和亚硝酸盐本身并没有那么致癌，但它们被烹调的方式和所处环境十分关键。”世界癌症研究基金科学与公共事务执行总监凯特·艾伦（Kate Allen）指出，“例如，加工肉中的亚硝酸盐和蛋白质同时存在。在高温下烹调时，它们就会更容易形成致癌的亚硝酸胺。”硝酸盐本身惰性较高，很少参与人体内的化学反应。但亚硝酸盐和由亚硝酸盐形成的其它化学物质则活跃得多。我们遇到的大多数亚硝酸盐都不是直接通过饮食摄入的，而是由硝酸盐在口腔细菌的作用下转化而成的。口腔中产生的亚硝酸盐被吞入胃中后，便可能在强酸性环境中发生化学反应，形成亚硝胺类物质。其中有些可以致癌，与肠癌相关。

但亚硝酸盐并非有百害而无一利，有越来越多的证据显示，通过亚硝酸盐产生的氧化一氮可能对心血管及其他身体器官有利。1998年，三名美国科学家因对氧化一氮气体在心血管系统中作用的研究获得了诺贝尔奖。如今我们知道，该物质可以扩张血管、降低血压、还能帮助人体对抗感染。如果人体生成该物质的能力受限，就可能引发心脏病、糖尿病和勃起障碍。

在此基础下，来自瑞典卡罗林斯卡学院（共获得5次诺贝尔生理学或医学奖）生理与药理学系的几位研究人员（部分为诺贝尔奖选拔委员会成员）联合德国弗莱堡仪器（有着先进的电子顺磁共振（EPR）波谱技术，Magnettech母公司，代表产品MS-5000）生物物理学实验室共同研究了无机硝酸盐和亚硝酸盐对AMPK（腺苷酸活化蛋白激酶）的活化及对NADPH氧化酶的抑制在预防肝脏脂肪变性中的作用并在美国国家科学院院刊（PNAS）上发表。

肝脂肪变性，或称脂肪肝，是世界上常见的肝病，影响着25%的美国人，目前还没有药监局官方批准的药物可用于治疗脂肪肝。脂肪肝可能会进展到严重的疾病，包括脂肪性肝炎，纤维化和肝硬化。高龄和不健康的饮食习惯会提高肥胖和2型糖尿病的发病率，这些代谢紊乱往往伴随着氧化应激和一氧化氮（NO）信号的减弱，增加了心血管并发症和脂肪肝疾病发展的风险。

该研究组研究了在饮食中的硝酸盐（在绿叶蔬菜中含量很高）对与代谢综合征相关的肝脂肪变性的治疗作用。在啮齿动物和人类代谢综合征模型中表明，通过简单的饮食方法可以预防脂肪肝。存在于绿叶蔬菜中的无机硝酸盐在体内通过共生宿主细菌的过程转化为一氧化氮。饮食中的硝酸盐是硝酸盐-亚硝酸盐-一氧化氮通路的燃料，存在于绿叶蔬菜中的无机硝酸盐在体内通过共生宿主细菌的过程转化为一氧化氮，它可以防止在喂食高脂肪食物的小鼠中出现的代谢综合征和肝脏脂肪变性出现的许多特征。然后，一氧化氮诱导关键代谢调节途径，最终减少氧化应激和改善心脏代谢功能。

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Fig.1. 饮食硝酸盐对肝脏代谢信号通路的影响。（这是一个简化的示意图，说明了饮食硝酸盐对减轻饮食诱导的肝脂肪变性产生影响的一些关键途径。）

该实验共分三个阶段，分别对小鼠、人体HepG2细胞及人体原发性肝细胞球（PHH）进行实验。在第一阶段中，通过用自旋捕获剂捕获血液和肝脏组织中两种特定的一氧化氮衍生物种和细胞中的亚硝酸盐，并用EPR检测捕获后的信号来证实体内由于硝酸盐而产生的一氧化氮。之后使用EPR检测全血和肝脏DNICs（dinitrosyl–iron complex）中的血红蛋白-一氧化氮加成物，证实了体内硝酸盐还原为一氧化氮。此外，用二乙基二硫代氨基甲酸铁胶体（Fe DETC）作为自选捕获剂，通过EPR信号证明了培养的细胞中亚硝酸盐（¹⁵N）形成了一氧化氮（¹⁵N）。

在第二阶段中，该研究组为了进一步确定活性氧族（ROS）的性质和起源，进行了一系列额外实验。在HepG2细胞中，超氧化物歧化酶（SOD）显著减少了NADPH衍生的化学发光信号，而与过氧化氢酶对信号没有影响，因此证明分析目标主要是超氧化物的生成，而不是过氧化氢。这些结果都使用了EPR去证实（Fig. 2）。超氧化物的产生在很大程度上由支持NADPH氧化酶作为主要来源的细胞膜组分决定，而不是像线粒体这样的胞质组分。脂肪变性一般伴随着超氧化物生成的增加，而超氧化物的生成可以通过亚硝酸盐进行抑制。（Fig. 2A）在由脂肪变性的HepG2细胞分离的细胞膜组分中检测出的羟基加成-捕获剂（DMPO-OH）的EPR信号被NADPH氧化酶混合抑制剂显著降低，并被SOD（Fig. 2B&C）消除。

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Fig. 2. HepG2细胞中超氧化物产生的EPR评估。

在这之后，该实验组还通过EPR捕获实验发现，在非布索坦片（一种痛风药物）的存在下，亚硝酸盐衍生的一氧化氮信号被减弱（Fig. 3）。这表明了黄嘌呤氧化还原酶（XOR）参与了亚硝酸盐的生物活化作用并且表明HepG2细胞中存在额外的亚硝酸盐还原酶。

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Fig. 3. 通过EPR对HepG2细胞中亚硝酸盐引导一氧化氮的产生进行证实（使用Fe-DETC作为自旋捕获剂）

最后，该研究组得出结论，饮食中的硝酸盐可减轻氧化应激，并在心肌代谢功能障碍的小鼠模型中保持肝AMPK活性，对心血管和代谢功能有有益的影响。这些影响似乎是由亚硝酸盐依赖XOR进行还原并依赖细菌进行形成后产生的一氧化氮导致。此外，硝酸盐和亚硝酸盐在所有三个阶段（小鼠、人体HepG2细胞、PHH）实验中都有效地防止了饮食诱导的肝脂肪变性。因此，进行用以证明饮食中添加硝酸盐是否有助于预防和治疗二型糖尿病及其并发症的临床试验会是非常有意义的。

EPR是由不配对电子的磁矩发源的一种磁共振技术，可用于从定性和定量方面检测物质原子或分子中所含的不配对电子，并探索其周围环境的结构特性。对自由基而言，轨道磁矩几乎不起作用，总磁矩的绝大部分（99%以上）的贡献来自电子自旋，所以电子顺磁共振亦称“电子自旋共振”（ESR）。在此研究中的EPR实验结果均使用了先进的EPR技术（德国Magnettech MiniScope MS5000）去证实。该仪器有着高灵敏性、高稳定性、操作简便及检测高效的优点。

文献原文：Cordero-Herrera, I., Kozyra, M., Zhuge, Z., McCann Haworth, S., Moretti, C., Peleli, M., Caldeira-Dias, M., Jahandideh, A., Huirong, H., Cruz, J., Kleschyov, A., Montenegro, M., Ingelman-Sundberg, M., Weitzberg, E., Lundberg, J. and Carlstrom, M. (2018). AMP-activated protein kinase activation and NADPH oxidase inhibition by inorganic nitrate and nitrite prevent liver steatosis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 116(1), pp.217-226.

关于德国Magnettech电子顺磁共振波谱仪（EPR）

EPR MiniSpcope MS 5000/5000X

MiniSpcope MS 5000/5000X系列电子顺磁共振波谱仪（EPR）采用了电磁体和微波桥紧凑设计，实现了两倍以上的信噪比提升，具有高灵敏度和磁场稳定性，科研级台式波谱仪。MiniSpcope MS 5000/5000X系列电子顺磁共振波谱仪（EPR）拥有快捷简便准确的定量测试方法和完善的数据处理和分析系统，它还具有小巧轻便灵活的特点，为科研工作者带来便捷。

MiniSpcope MS 5000/5000X系列电子顺磁共振波谱仪（EPR）的应用对象主要是含有未成对电子的物质，可用于研究自由基、过渡金属离子、催化反应机理、大气颗粒物（PM2.5）、污水处理高级氧化机理、化学反应动力学、环境中持久性自由基EPFRs、材料缺陷、掺杂、酶活性、蛋白质结构、辐射剂量、地质测年等。

EPR应用实例

1. 环境化学：污水处理，大气颗粒物

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