前言
在提升LNP-mRNA转染效力的问题上,多数研究者会采用两种方式:1.更换已公开的配方进行尝试;2.开发新的可电离脂质。从逻辑上讲,两种方式都没有问题,但如果对配方过程的优化更深一步,相信新的发现会指引我们更好的解决问题。下文将主要介绍LNP-mRNA合成时酸性缓冲液的变化带来的一系列影响。
缓冲液类型和浓度的变化诱导泡状结构形成
研究人员采用KC2脂质配方,具体组成为KC2/DSPC/胆固醇/PEG-DMG (50/10/38.5/1.5 mol%),引入Dil或Dio(荧光染料适用于FRET分析)。在包裹mRNA时使用多种pH4缓冲液,分别为:25 mM NaOAc、300 mM NaOAc、300 mM CitPhos及300 mM Na-citrate,包裹完成后在pH 7.4的PBS中透析。
表1.使用不同pH 4缓冲液配制的LNP-mRNA体系平均粒径、PDI和包封效率
对比表1中数据可知,酸性缓冲液的类型、浓度对所制备粒子的粒径、PDI及包封率均有影响。总体上看,粒子的直径与缓冲液浓度呈正相关关系,包封率则恰好相反。
图1.高浓度pH 4缓冲液中合成的LNP-mRNA可诱导泡状结构的形成并提高体外转染效率
当酸性缓冲液为25 mM的NaOAc时,仅观察到LNP-mRNA“实核”结构,未有明显泡状结构形成(如图1d);而在300 mM NaOAc、CitPhos及Na-citrate的缓冲条件下,体系分别显示出LNP总面积5%、44%和59%的泡状结构(图1c、e、f、g)。
用不同缓冲条件下制备的LNP-mRNA孵育Huh7细胞,24小时检测其发光强度。如图1b所示,在300 mM条件下制备的LNP-mRNA,其发光强度远高于在25 mM条件下制备的。由此推测,泡状结构的形成有利于增强mRNA的转染效果,但转染效果的增强不能归因于摄取的增加(图2,摄取量未增加)。
可电离脂质的种类影响泡状结构的形成
研究人员选用了多种离子型脂质,通过低温透射电镜观察不同缓冲浓度下LNP-mRNA的形貌差异。选用的离子型脂质有MC3、ALC-0315和SM-102,缓冲液对比浓度为25 mM和300 mM。
表2为LNP-mRNA的物理参数,在300 mM的缓冲条件下,MC3和ALC-0315组粒子的尺寸显著增加,且包封率有下降;而SM-102组的粒子尺寸和包封率都维持的非常好。
观察图3a中的细胞孵育结果,相比于25 mM缓冲液,在300 mM条件下,三种脂质所对应的体系荧光强度分别增加了20倍、4倍和2倍(0.3 μg mRNA/mL)。统计电镜数据可得(图3d-i),泡状结构占比也从2%、4%和53%提升为76%、21%及更大结构的气泡。由此可见,缓冲液浓度的提升真实的提高了LNP-mRNA的转染效力,即使包封率有所下降,而可电离脂质的不同也会对泡状结构的水平产生影响。
表2. 不同缓冲浓度下形成的LNP-mRNA粒径、PDI及包封率参数
具有泡状结构的LNP-mRNA可提升小鼠体内转染水平
接下来,研究人员针对KC2和SM-102所在的配方进行体内研究。以0.5 mg/kg的mRNA剂量静脉注射给CD-1小鼠,在注射后3、6、24小时检测生物发光。
如图4所示,与25 mM NaOAc缓冲液相比,使用300 mM Na-citrate缓冲液制备的两种LNP-mRNA在肝脏和脾脏中的基因表达均显著提高,KC2相较于SM-102表现出了更优越的转染效力,且两者在注射后24小时仍可观察到荧光蛋白的表达。
最后,研究人员进行了毒性测试。结果表明,在较高缓冲浓度下制备的LNP-mRNA没有引发更强的毒性。注射后24小时,两种(不同缓冲液浓度下制备)LNP-mRNA制剂的血液学、生物化学及细胞因子参数水平无显著差异(图5)。
图5.LNP-mRNA有无泡状结构系统毒性无显著差异
泡状结构可增强被封装mRNA的完整性
图6.不同缓冲条件下mRNA完整性及翻译能力对比
泡状结构的出现为何能显著提升LNP-mRNA的转染性能,针对此问题,研究人员进行了大量的论述,认为泡状结构的出现增强了被封装mRNA的完整性。此结论或许还需要更多的研究来进行证明,但图6、图7的数据也从某种程度上说明了这种结论的可靠性。300 mM的缓冲条件下,mRNA具有更强的翻译能力,且制成的LNP-mRNA在50% FBS中孵育一段时间后,显示出更好的mRNA完整性。总而言之,这些数据或推论,对于此领域的研究有着重要的指导推进作用。
图7.mRNA完整性检测
结论:
通过对配方过程的深入优化,作者给予我们了一个重要结论,即酸性缓冲液的类型/浓度变化会大大影响LNP-mRNA的形貌及性能,这也为提升mRNA转染效力打开了一扇全新的大门,让研究者在关注可电离脂质开发之余,也关注mRNA的完整性及封装相关的重要参数,诸多考量,多向发力,定能加速此领域开发前进的步伐。
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