蛋白质的定量测定方法:微量凯氏定氮法
【实验目的】
学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
微量凯氏定氮法【实验原理】
凯氏定氮法用于测定有机物的含氮量,若蛋白质的含氮量已知时,则可用此法测定样品中蛋白质的含量。
当蛋白质与浓硫酸共热时,其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳和水,而氮则转变成氨,并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。但是,这个反应进行得比较缓慢,通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点,并加入硫酸铜作为催化剂,以促进反应的进行。
消化完成后,在凯氏定氮仪中加入浓碱,可使消化液中的硫酸铵分解,游离出氨,借助水蒸汽蒸馏法,将产生的氨蒸馏到量、浓度的硼酸溶液中,硼酸吸收氨后,氨与溶液中氢离子结合,使溶液中的氢离子浓度降低,指示剂颜色改变,然后用标准无机盐酸滴定,直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止。根据所用标准盐酸的量可计算出待测物中的总氮量。
蛋白质的含氮量为16%,即1克蛋白质中的氮相当于6.25克蛋白质,用凯氏定氮法测出的含氮量乘以6.25,即得样品中蛋白质的含量。
微量凯氏定氮法【实验材料】
1.实验器材
微量凯氏定氮仪1套;50ml凯氏烧瓶4个;移液管;锥形瓶;试管;小玻璃珠
2.试验试剂
(1)浓硫酸;30%氢氧化钠溶液;2%硼酸溶液;标准盐酸溶液(0.01mol/L)。
(2)粉末硫酸钾—硫酸铜混合物:K2SO4与CuSO4·5H2O以3:1配比研磨混合。
(3)混合指示剂(田氏指示剂):由50ml0.1%甲烯蓝乙醇溶液与200ml0.1%甲基红乙醇溶液混合配成,贮于棕色瓶中备用。
(4)样品溶液:配制3mg/ml的牛血清白蛋白溶液作为样品。
【实验操作】
1.安装凯氏定氮仪。
2.消化:取4个50ml凯氏烧瓶并标号,各加1颗玻璃珠,在1号及2号瓶中各加样品1ml,催化剂(K2SO4-CuSO4·5H2O)200mg,浓硫酸5ml。注意加样品时应直接送入瓶底,而不要沾在瓶口和瓶颈上。在3号及4号瓶中各加1ml蒸馏水和与1、2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸,作为对照。在通风橱内进行消化。
在消化开始时应控制火力,不要使液体冲到瓶颈。待硫酸开始分解并放出SO2白烟后,适当加强火力,继续消化,直至消化液呈透明淡绿色为止。撤掉火力,冷却至室温。
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