Cytek用户发表43色免疫表型分析方案，光谱流式多色应用再上台阶！

Cytek Biosciences

2021/02/19 09:32

2020

12.20

CYTEK

2020年12月20日, Cytometry A上发表了一篇43色免疫表型分析方案的文章，这是继Cytek 40色文章后，以光学为基础的流式细胞术多色方案的再一次突破！文章中的43色方案基于Cytek Aurora全光谱流式细胞仪开发，作者是来自卡塔尔Hamad医疗集团的Fairooz Sahir等研究者，这也是Cytek用户发表的首个40以上的多色方案。这一方案的发布，不仅再次证实了Cytek光谱流式强大的多色检测能力，也意味着越来越多的流式用户的多色研究进入了新的超多色时代！

近年来，尽管有很多以光学为基础的流式细胞仪，声称可以分析超过30个参数，但由于传统流式技术仅接受发射光谱波峰信号的技术局限，以及缺乏能被常用激光器（如紫外、紫、蓝、黄绿和红激光等）激发且具有独特光谱特征的荧光素，开发一个可用于免疫细胞表型分析的40+色方案，仍然非常具有挑战性。光谱流式独有的全光谱收集及分析技术，能够区分发射光谱高度重叠的荧光素，允许在同一方案中使用光谱相似的荧光素，如BB515和FITC。使得在相同激光配置下，更高参数的检测成为可能！

Fairooz Sahir等研究者，基于5激光配置的Cytek Aurora全光谱流式细胞仪，开发了一个人免疫表型分析的43色方案。可检测人免疫系统中的大多数的免疫细胞亚群，覆盖常规T细胞，非常规T细胞--如恒定自然杀伤T细胞（iNKT）、γδT细胞（TCRVδ2，TCRVγ9）和粘膜相关恒定T细胞（MAIT）等，B细胞，自然杀伤（NK）细胞，浆细胞样树突状细胞，树突状细胞，造血祖细胞，嗜碱性粒细胞和先天性淋巴细胞（ILC）(CD117, CRTH2) 亚群。方案同时包括分析激活（CD38，HLA‐DR，ICOS / CD278），分化（CD45RA，CD27，CD28，CD57），细胞因子和趋化因子受体（CD25，CD127，CCR10，CCR6，CCR4，CXCR3， CXCR5，CRTH2 / CD294）以及共抑制和耗竭分子（PD-1，CD223 / LAG-3，TIGIT）的标记，允许对外周血中的PBMCs进行深入的表型分析，帮助研究人员全面探索和分析免疫系统，对于样本非常珍贵或标本数量较少的情况，显得尤为重要 。研究者指出，尽管该方案还未最终优化完成，但希望文章的发表能对其他开发和优化多色方案的工作流程起到指导作用。

图1-43色方案包括的标记及荧光素

文章中的免疫表型分析方案使用42种表面标记及一个死活染料，来全面描述人类外周血单个核细胞，覆盖了人类外周血中超过130种不同的细胞亚群，包括所有主要的免疫细胞亚群和造血干细胞（HSCs）。获取数据后，按图2显示的设门策略，一步一步鉴定出目标细胞亚群。手动设门之前，合并来自七个重复样本数据中的单个活细胞数据为一个FCS文件。具体的设门逻辑请参考图2或文章原文。

图2-从外周血PBMCs中鉴定131个免疫细胞亚群的设门策略

图2 中各字母缩写分别表示：Bregs-调节B细胞；CM-中央记忆细；DC-树突状细胞；DP-双阳性；EM-效应记忆；EMRA-效应记忆重新表达RA；ILC-先天淋巴细胞；Neg-阴性；Pos-阳性；Treg-调节T细胞；pDC-浆细胞样树突状细胞；SP-单阳性。

文章对光谱流式给予了很高的评价，研究者认为，光谱流式细胞术消除了传统流式细胞术的一些缺点，通过检测完整的发射光谱信号及后续的数据解析，来实现对单个荧光素的识别。这允许在单个方案中，同时使用具有相似的激发光和最大发射峰值的荧光素，从而大大增加了可同时分析的蛋白标记的数量。以常见的荧光素组合举例，如BV421–Pacific Blue, BV480–SYTOX Blue, eFluor506–BV510, Brilliant Blue 515–FITC, PerCP–Brilliant Blue 700–PerCP–eFluor710, CF555–PE–CF568, PE/Dazzle594–CF594–PE–Alexa Fluor 610, 及 APC–Alexa Fluor 647等，这些组合在传统流式上是无法实现的。

Cytek提供了许多研究工具，协助研究人员进行多色方案的设计。文章中所提到的Cytek Full Spectrum Viewer (https:// spectrum. cytekbio. com) ，即Cytek全光谱查看器，就是非常有用的一款工具。用户可在查看器界面获取各荧光素的全光谱信息，还可了解不同荧光素之间的相似性指数，及所设计的方案的复杂度指数等信息，帮助多色方案的开发与优化。

图3-Cytek全光谱查看器

文章的43色方案覆盖了外周免疫系统中的大多数免疫细胞亚群，有助于研究者全面了解免疫系统，尤其是在从患者处获取的标本有限的情况。研究者用实际的数据证明，使用基于荧光染料的方法进行超高维流式细胞术是可行且具有独特优势的。此43色方案，是继Cytek 发表40色方案后，第二篇超过40色的基于光学流式的多色方案，是对Cytek全光谱流式细胞术超强多色能力的再次证明。

Cytek Aurora 全光谱流式细胞仪

超多检测通道：5激光配置高达64个荧光检测通道

更多颜色组合：可以实现40色及更多颜色组合

超高灵敏度：使用先进的光学和低噪音电子系统，重新定义系统灵敏度

无限灵活性：无需更换滤光片，可使用任何能被机载激光器激发的荧光染料

超级性价比：可以满足广泛应用的高性能系统

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