2020年8月，Cytometry A上发表了一篇名为Evaluating spectral cytometry for immune profiling in viral disease的文章，对光谱流式在多色免疫分析中的数据进行了系列评价，包括与传统流式的对比，作者是来自澳大利亚Charles Perkins Centre的Paula Niewold等研究者。
研究者认为，光谱流式采用全光谱信号收集阵列替代传统流式单一目标探测器的设计，此原理的不同，使得在光谱流式上可以获得每个荧光基团更为详细的荧光信号，不仅提高了方案设计的灵活性，同时改善了检测到的荧光信号。为了探讨在进行十几色以上的多色方案的检测时，来自不同系统（光谱流式和传统流式）的数据表现，研究者设计了系列多色实验，对来自不同系统数据的信号质量、SE（溢漏）程度、和信号分辨率等进行了比较，并比较了补偿和解析不同算法对光谱数据结果的影响，以了解光谱解析算法所带来的潜在优势。
表1
实验中所使用的抗体信息
实验选择8-12周龄雌性C57BL/6小鼠的骨髓、脾脏和脑组织，经处理后制备成单细胞悬液，用表1中的抗体（一个常规免疫细胞方案和一个7色T细胞方案）进行染色后，分别在4激光和5激光的传统流式细胞仪，和3激光的Cytek Aurora光谱流式细胞仪上进行样本获取，并用FlowJo v10.6.1 (BD)，SpectroFlo (Cytek)和PRISM (GraphPad)等软件进行数据分析和制图。
研究者比较了小鼠不同组织来源的样本、及用补偿微球获得的数据值，发现在某些情况下，不同系统所获得的数据是具有可比性的，如补偿微球的CV值、骨髓中免疫细胞方案的数据表现等。而在某些情况下，来自不同系统的数据，是有明显差异的。下面，我们重点来看一下有差异的部分数据。
1
光谱流式有更低的
信号溢漏和更高的分辨率
图 1
传统流式与光谱流式的信号值
从图1中可以看出，几乎所有被检测的荧光分子信号，在光谱流式上都表现出更低的溢漏值，对应的，大多数荧光分子体现出更高的分辨率。研究者进一步针对光谱流式的数据，比较了补偿和解析算法，发现无论采用解析算法还是补偿算法，溢漏或分辨率值仅发生了微小变化。
2
脾组织细胞的T细胞数据，
光谱流式表现更好
图 2
脾细胞的T细胞检测数据
用一个7色T细胞方案（包括胞内标记）对小鼠脾组织细胞中的Treg细胞进行检测，研究者发现，尽管来自不同系统的数据相似，但在光谱流式上，BV711 CD8α对AF700 CD4的溢漏影响得到明显改善，同样的，还有APC FoxP3 的分辨率也得到了很大的提高。（图2）
3
光谱流式独有的自发荧光提取
图 3
脑细胞检测数据自发荧光提取前后对比
光谱流式的一个独特优势是可以检测自发荧光。对未染细胞进行荧光光谱采集，将其作为一个荧光分子信号，在后续检测中加以利用，或可将此信号作为样本特征信号帮助识别细胞，或可将其扣除以提高目标信号的分辨率。这一功能对于肝脏、脑、皮肤等高自发荧光的样本尤为有用。在这篇文章中使用的脑组织样本，在500-650nm有很高的自发荧光，在紫激光和蓝激光对应的探测器上都能检测到明显的信号，从而对目标信号产生干扰。利用光谱流式的自发荧光提取功能进行自发荧光扣除，将大大提高数据信号分辨率。如图3所示，BV510和FITC，以及BV605和PerCP上的数据，扣除自发荧光后，相较于扣除前，细胞群的分辨率都得到了明显改善。
小结与讨论
文章通过一系列的实验数据对比，认为整体而言传统流式与光谱流式所产生的数据是具有可比性的，但两种方法之间，仍然有很多不同之处。研究者认为，光谱流式细胞术通过对每个荧光基团的荧光光谱的进行详细检测，相较于传统流式细胞术，提供了许多潜在的优势。
多色实验中，两个系统提供的信号分辨率具有可比性，但在多数情况下，光谱流式通常有更低的溢漏值，最终体现为有更好的数据分辨率。
光谱流式独有的自发荧光提取功能，可进一步提升信号分辨率，这对于那些自发荧光高的细胞或组织样本，尤其具有价值。
光谱流式能够很好区分高度重叠的染料，比如APC（或AF647）、AF700、APC-Cy7（或APC/H7）等，从而使得荧光染料的选择更加广泛，多色实验方案设计更为灵活。
解析与补偿算法虽不能消除SE，但通常会使其降低；除个别例外，全光谱信号收集及解析算法，较补偿算法，往往会对应更高的分辨率。
最后，研究者提出，全光谱检测的流式细胞术已经发展了一段时间，是在商业领域中逐步成熟的一项新兴技术。相较于传统流式技术，光谱流式已经逐渐展现了一些明显的优势，应该被纳入常规的流式细胞分析方法中。
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