本文要点:近红外二区(SWIR:900−1700nm)和红外一区(NIR:650−900 nm)发光在深部组织中具有较低的光散射和较高的信噪比与传统的发光相比,在生物医学领域越来越受到重视。体外和体内研究表明,mMGOs可反复表达激活以实现可再充电的持续发光成像,用于跟踪老鼠。
与常规荧光纳米颗粒相比,持续发光纳米颗粒(PLNPs)可以有效地避免光散射和组织自发荧光干扰,以实现生物医学成像增强的灵敏度和信噪比(SNR)。特别地,金属离子掺杂的PLNPs具有许多优点,例如良好的光稳定性,窄发射带和长的余辉寿命。作为一种重要的稀土离子,通常使用YB3 +来增强持续发光特性,但一些研究中的激发主要是UV或发光二极管光,其具有在实现由于组织穿透深度的限制而导致的深度成像的重复激活的限制。
与这些激发源相比,X射线在生物组织中具有几乎无限的渗透深度,散射越弱和层析的简化图像重建,这被证明是一种有效的激励能量源,以产生更好的空间分辨率的更深成像的发光。因此,通过简单地调节稀土离子的价态来优化它们的发光,以实现X射线激活的二合一的近红外和短波红外持久发光,以实现体内的可再生成像,是一种迫切的需求。
这里,作者通过简单地调节稀土离子的价态,设计了介孔二氧化硅包覆的Yb掺杂锗酸镁纳米颗粒(MMGO),X射线照射后,它具有良好的二合一的近红外(NIR)和短波红外(SWIR)的持久发光,并且在肿瘤区域具有高的载荷量和可控的释放轮廓。体外和体内的研究表明,重复激活MMGO,以实现用于跟踪小鼠货物输送的可充电持续发光成像。此外,刺激的药物释放曲线有效抑制肿瘤生长。X射线激发的二合一近红外和SWIR持久发光成像不仅可以对深部肿瘤进行可充电成像,而且可以实现长期跟踪,具有显着的抑瘤效果。
图1:(A)MgGO的TEM图像,比例尺:200 nm;(B)扫描透射电子显微镜−能量色散X射线能谱(EDS)的MgGO元素图谱图像,比例尺:50 nm;(C)MgGO的XEOL和XEPL谱;(D)X射线激发的MMGO的近红外持久发光衰减图像;(E)X射线激发的MMGO的SWIR持久发光衰减图像;(F)用1.5 cm厚的猪肉切片在停止X射线照射后不同时间(0、5和10min)检测到X射线激发的近红外(NIR)持久发光;(G)用1.5 cm厚的猪肉切片在停止X射线照射后不同时间(0、5和10min)检测到X射线激发的近红外(NIR)体内持久发光。
一、合成和表征
Yb2+/Yb3+纳米颗粒(MMGO)透射电子显微镜(TEM)图像显示,mMGO分散均匀,二氧化硅外壳为24.5±2.5 nm(图1a)。X射线衍射(XRD)分析表明,MgO核为钛铁矿结构的MgGeO3,MgO在近红外和SWIR X射线激发下同时发射出强烈的近红外和短波红外X射线的光学发光(XEOL)(图1c),证实了Yb2+和Yb3+在MgO中的共存和能量转移。停止X射线照射后,仍然可以检测到近红外和SWIR的持久发光(图1c)。为了验证其潜在的持久发光应用,用X射线(25mGy)照射5 mg MgO,用IVIS系统和NIR-Optics SeriesIII900/1700系统采集不同时间点的X射线激发持久发光(XEPL)衰变图像。近红外和SWIR持久发光均可检测到超过30分钟(图1D,e)。更重要的是,X射线照射可以反复激活这种持久发光(图1D,e)。即使在X射线照射后很长一段时间内,信噪比也是相对较高的。近红外持久发光信号强度随X射线剂量的增加而增大,且呈现剂量依赖关系。通过记录不同辐照时间后的持续发光衰减图像,还发现X射线辐照的饱和时间为2min。
二、深部组织的X射线充电近红外持久发光成像
为了显示组织的深度穿透,在mMGO(5毫克)和X射线源之间放置了一块1.5厘米的猪肉切片。停止X射线照射(25mGy)后,分别于照射后0、5、10min进行显像。强的近红外持久发光在照射点清晰地发射,并且即使在X射线照射三个周期之后也没有衰减地重复刺激(图1f)。这证实了MMGO具有很强的辐射稳定性。为了证实X射线照射剂量(25mGy)的生物安全性,评估了X射线照射后HepG2细胞的存活率和小鼠皮肤的损伤。结果表明,细胞存活率无明显下降,皮肤无明显损伤,说明X射线照射剂量是生物安全的。在此基础上,进一步在体内验证了自由自发荧光的深度成像。
图2:(A)DOX、MMGO和DOX-MMGO的吸收光谱;(B)不同pH值(7.4和5.6)的DOX-mMGO的DOX释放行为;(C)不同时间点(1、4、8h)DOX-mGO孵育HepG2细胞后的共聚焦图像;蓝色和红色分别代表Hoechst 33342和DOX荧光(比例尺:40μm);(D)不同浓度的mGO与HepG2细胞孵育24h后的存活率;(E)用不同浓度的DOX-mGO和DOX孵育HepG2细胞24小时后,观察细胞存活率。
三、药物装载和释放
介孔层具有较高的比表面积(175m2g−1)和中孔尺寸(3.3nm),表明mMGO可用于货物的包裹和输送。将抗癌药物DOX成功地包裹到mMGO(DOX-mMGO)中,载药量为64.3%(图2a)。包埋后的DOX-mGOS在PBS、Dulbecco‘s Modified Eagle’s培养基(DMEM)和胎牛血清(FBS)等不同介质中均表现出良好的胶体稳定性。通过研究DOX-mGO在PBS缓冲液(pH 7.4和pH 5.6)中的释放行为。从图2B可以看出,在酸性条件下,DOX分子中的氨基发生质子化反应,增加了DOX的溶解度,从而促进了DOX从mMGO中的快速释放。这些结果表明,低剂量的X射线可以有效地穿透深层组织,而传统的光学激发在这方面面临着巨大的挑战,这种激活实现了高效和可充电的近红外持久发光,用于在酸性肿瘤微环境中对深层组织进行超灵敏成像,追踪DOX释放。
四、体外实验
接下来,使用HepG2人肝癌细胞系评估了DOX-mGO的细胞摄取和细胞内释放行为(图2c)。孵育4h后,由于DOX-mGO的内吞作用,细胞内出现微弱的DOX红色荧光信号,且主要分布在胞浆中。随着孵育时间的延长,8h胞浆和胞核出现明显的红色信号,说明DOX由胞内DOX-mGO逐渐释放并进入胞核。在与MgGO孵育24小时后,即使高剂量的200μg m L−1,HepG2细胞的存活率也超过85%(图2 d)。在加载DOX后,DOX-mMGOS显示出与游离DOX相似的癌细胞杀伤作用(图2e),显示了这种药物加载策略的高效性。
图3:(A)静脉注射后血液中MgO水平的时间进程;半衰期(t1/2)为3.0±0.4h;(B)静脉注射后不同时间点mMGO在主要器官和肿瘤中的生物分布;将mMGO浓度归一化为每克器官注射镁元素的百分比(%ID g−1);(C)静脉注射mMGO后,体内X射线激发的近红外持久发光成像;(D)瘤内注射MgGO后的体内X射线激发SWIR持久发光成像。
五、体内生物分布和生物安全性评价
此外,采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)定量分析了DOX-mGO静脉注射HepG2荷瘤小鼠后组织中镁离子的含量,以评价DOX-mGO在体内的循环和生物分布。DOX-MGO的循环时间相对较长,半衰期为3.0h±0.4h(图3a),导致DOX-MGO在肿瘤中有效积聚,注射后8h每克组织的注射剂量(%ID g−1)为6.1%(图3b)。血清化学和血液学分析表明,DOX-mGOS对肝功能、肾功能和血液指标无明显影响,表明DOX-mGOS在体内具有良好的生物相容性。
六、在活体X射线充电的近红外和SWIR持久发光成像
在确认了体内生物安全性后,进一步研究了mMGO的近红外(NIR)和短波红外(SWIR)体内持久发光成像。静脉注射MGO(3.5mgkg-1)后,用低剂量X射线(25mGy)照射肿瘤区域,并在注射后不同时间点用IVIS系统立即进行显像。皮下肿瘤内可见强信号,注射后8h信号最强(图3c)。离体器官的近红外持久发光成像显示肿瘤对mMGO摄取一致。此外,作者还研究了体内X射线激发的SWIR持久发光成像。在瘤内注射MgO(20 mg kg-1)并随后进行X射线照射后,即使在停止X射线照射后,仍可在高信噪比的肿瘤中检测到较强的SWIR发光信号(图3D)。此外,还评估了肌肉注射近红外持久发光成像的信噪比。
图4:(A)PBS、mMGO、DOX和DOX-mGO不同治疗后14天内的肿瘤体积曲线;误差条基于平均值±标准差(n=5);(B)治疗0、6和14天后不同组小鼠的代表性照片;(C)14天后切除肿瘤的典型照片;(D)肿瘤组织14天内进行HE染色(比例尺:100μm);(E)PBS、mMGO、DOX和DOX-mMGO不同处理后14天的体重增长曲线;(E)14天后肿瘤切片HE染色(比例尺:100μm)。
七、在活体化疗中
在证明了持续发光成像在体内具有良好的示踪能力后,在体内用HepG2荷瘤小鼠评估了其抗癌效果。如图4a所示,PBS和mMGOS组的肿瘤生长迅速,而作为对比,游离DOX和DOXmMGOS组抑制了肿瘤的生长。此外,DOX-mMGOS组的抑瘤率高达75.0%(与PBS组相比),远高于游离DOX组(35.4%)。小鼠和分离肿瘤的典型照片显示出与肿瘤生长曲线一致的结果(图4b,c)。这些结果表明,更多的DOX分子被有效地运送到肿瘤中,并从DOX-mMGO中迅速释放。苏木精伊红(H&E)染色显示DOXmMGOS组肿瘤组织结构损伤更明显,提示其对HepG2的抑瘤作用更强(图4d)。此外,在所有治疗组的终点没有明显的体重下降(图4e);然而,注射后游离DOX的体重略有下降,表明游离DOX的副作用更大。
总体而言,所制备的mMGO将是一种很有前途的二合一持久发光和可充电显像剂,用于追踪深层组织中的药物释放。
参考文献
Ding D, Li S, Xu H, Zhu L, Meng S, Liu J, Lin Q, Leung SW, Sun W, Li Y, Chen H. X-ray-Activated Simultaneous Near-Infrared and Short-Wave Infrared Persistent Luminescence Imaging for Long-Term Tracking of Drug Delivery. ACS Appl Mater Interfaces. 2021 Apr 14;13(14):16166-16172. doi: 10.1021/acsami.1c02372. Epub 2021 Apr 2. PMID: 33797886.
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