Julolidinyl aza-BODIPYs 作为 NIR-II 荧光团用于纳米载体的生物成像

本文要点：聚集引起的猝灭（ACQ）原理已被用于通过排除自由探针衍生的干扰来提高纳米载体的荧光成像精度。然而，由于生物组织的吸收和衍射以及组织衍生的自发荧光，NIR-I （700–900 nm）生物成像的穿透力有限和时空分辨率低，削弱了其实用性。本研究旨在开发基于ACQ的NIR-II（1000–1700 nm）探针，以进一步提高成像分辨率和准确性。所采用的策略是基于较大的取代基效应，将高度平面和富含电子的Julolidine安装到氮杂-BODIPY的3,5位中。新开发的探针表现出显着的光物理特性，强吸收集中在大约 850 nm 处，明亮发射在 950–1300 nm 区域。与NIR-I对应物P2相比，NIR-II探头表现出优异的水敏感性和淬灭稳定性。ACQ1 和 ACQ6 在水馏分高于 40% 时表现出更广阔的 ACQ 效应，在孵育 24 小时后等离子体中荧光重照低于 2.0% ,具有更高的淬灭稳定性。理论计算验证了分子平面度对ACQ性能的影响大于疏水性。此外，体内和体外再照明研究显示，预淬灭ACQ1的信号干扰不到2.5%，而P2的信号干扰为15%。

小动物活体成像系统

图 1. 3,5-julolidinyl aza-BODIPYs作为NIR-II ACQ探针的设计理念

图2.  3,5-julolidinyl aza-BODIPYs的光谱和ACQ性质

烷基侧链对吸收和发射几乎没有影响，具有不同链的 ACQ1 类似物（ACQ9\u201214）保留了 ACQ1 出色的光物理性质，例如以大约 834–896 nm 为中心的强烈吸收（ε = 60,000–68,000 L/（mol·cm））和以大约 880–991 nm （Φ= 3.20%–3.89%）。同时，荧光成像表明，不仅在NIR-II区域（1000 LP滤光片）存在明显的荧光信号，而且在发射尾部也有一些通过1300 LP滤光片的荧光，这是NIR-II成像的优势区域（图2 C）。其中，ACQ6在这两种滤光片下表现出最亮的荧光，而ACQ7和ACQ8的荧光强度略弱。总体而言，3,5-julolidinyl aza-BODIPYs在NIR-II成像中表现出潜在的应用，在约850 nm处具有强烈的吸收，在NIR-II区域具有明亮的荧光。

图3.  3,5-julolidinyl aza-BODIPY标记的纳米载体的表征和荧光

受其高亮度、前景良好的水敏感性和出色的淬灭稳定性的启发，优化的 ACQ1 和 ACQ6 用于标记模型纳米载体、高动态 mPEG2k-PDLLA2k具有核/壳结构的PM和具有基体结构的相对稳定的PCL PN，通过以P2为参考的物理嵌入。为了确定探针在PMs和PNs中的负载能力，选择ACQ1作为模型探针，并研究了标记的PMs和PNs的浓度相关荧光强度。虽然较高的探针载样量可能具有较高的荧光强度，但浓度猝灭的效果会加速。因此，在配方中选择了目前的两个重量分数（0.25%和0.3%），以保证上样效率和最终荧光强度。由于其他探针具有相同的母体结构、相似的修饰部分，因此具有相似的物理化学性质，因此在标记纳米载体时，为其他探针预设了相同的负载水平。理想的ACQ探针应在纳米载体中分散良好，并发出明亮的荧光，但在水中应完全聚集并完全淬灭（图3 A）。用ACQ探针标记的PM在700-900 nm处表现出强烈的吸收，在大约950 nm处表现出明亮的发射，并尾随到NIR-II窗口，在850-1400 nm范围内具有1.54%-2.01%的量子产率，在1000-1400 nm范围内具有0.21%-0.29%的量子产率，即使在1300 nm以上的波长下也显示出明显的信号，与广泛而弱的吸收形成鲜明对比，在水中几乎没有排放，表明标记成功（图3 B）。同样，PN也被成功标记，并显示出比标记的PM更亮的荧光（图3 C）。然而，由于PN色散的显着光散射无法测量吸收，因此无法正确计算PN的量子产率。PMs与PNs的综合荧光强度的粗略比较表明，PNs的量子产率高于PMs，与它们的亮度一致，较亮的ACQ6和ACQ4标记的纳米载流子的荧光高于ACQ1，而较差的ACQ3标记的纳米载流子的荧光略低。尽管在DMSO中超过1300 nm的区域中，ACQ6比ACQ1更亮（图2 A和C），但由于纳米载流子内的极性较低以及由此产生的光谱蓝移，ACQ6标记的纳米载流子在PM的该区域显示出较弱的荧光。如图3 D所示，标记的PM和PN的流体动力学直径是单分散的，分别为21和210 nm;它们的 zeta 电位分别低于 ±10 和 ± 3 mV。透射电子显微镜（TEM）揭示了标记的PM和PN的球形形态和均匀的尺寸分布（图3 E）。这些探针被有效地封装在纳米载体中，EE超过90%，而ACQ3的EE为76.0%–81.6%。此外，标记的 PM 和 PN 在 24 小时内在 PBS 和等离子体中表现出优异的荧光稳定性（图3 F）。此外，NIR-II成像（ACQ1标记的PMs）具有较高的空间分辨率，可以清晰地显示全身血管结构，而NIR-I成像（P2标记的PMs）仅显示荧光区域的片段，而没有详细信息，证实了NIR-II成像的优越性（图3 G和H）。

图4. NIR-II ACQ 探针标记的纳米载体的体内和离体成像

为了证明NIR-II ACQ探针在体内纳米载体实时成像方面的优越性，通过尾静脉注射到小鼠体内后，研究了用 ACQ1 和 ACQ6 标记的 PM，以 P2 和劣质 ACQ3 为对照（图4 A）。由于较长的波长有利于减少散射和自发荧光，在1300 nm以上区域监测荧光。同时，还探索了预淬灭探针的体内复光。为了评估自由探针的再照明信号引起的干扰，在两者都容易积聚的肝脏区域测量标记的PM和预淬灭探针的荧光，并计算再照明的比例（图4 B）。ACQ1、ACQ3 和 ACQ6 标记的 PM 在 24 小时内表现出相似的生物分布。PMs主要分布在注射后2 h内的血管中。此后，血管信号逐渐消失，而PMs的肝脏潴留增加，由于单核吞噬细胞系统的摄取，PMs在8 h达到峰值。在P2的情况下，观察到类似的PM生物分布，但只记录了荧光区域的片段，没有透露任何细节。与具有高重照明的传统探头（DiR）相反，完全没有观察到再照明信号，并且由于其出色的ACQ特性，预熄灭的NIR-II探针在24小时内估计的再照明低于6%。在降低最大校准条后，在24小时时仅观察到ACQ1的微弱青色，荧光复照率低于2.5%。然而，在给药后2 h观察到预淬灭ACQ3的再照明信号，随着时间的推移而增加，并且在24 h时高达相应PM组中荧光信号的5%。尽管预熄灭的ACQ6显示出与ACQ1相似的低重照明，但其在PM组中的较低亮度导致重照信号的干扰相对较高。ACQ6的体内ACQ性能较差，与PM标记后的低亮度（图3 B）和PM分解后在极性溶剂中再分散后的荧光略高有关（图2 A和C）在1300 nm以上的区域。预淬灭 P2 的重新照明在注射后 8 小时明显，假信号不可忽略。假信号随时间增加，在24 h时高达PM荧光的14%，这不可避免地干扰了纳米载体体内命运的探索。

为了研究PMs的生物分布和离体游离探针的干扰，在24 h处死小鼠，并解剖和成像各种器官和组织。如图4C所示，所有标记的PMs均表现出相似的生物分布趋势，主要分布于肝脏、脾脏、肺和肾脏;适度分布于心脏、皮肤和脂肪组织;在大脑和肌肉中的分布有限，与体内结果一致。注射预淬火的NIR-II探针后，除了肝脏、脾脏和肺外，在器官和组织中几乎没有观察到荧光信号，这些器官和组织只检测到微弱的荧光。ACQ1的再照射干扰最小，而ACQ3和ACQ6在肝脾肺的复照百分比增加，这是由于ACQ3的荧光恢复率高，ACQ6的PM组荧光强度低。尽管与 P2 相比，脾脏或肺部预淬灭的 ACQ3/ACQ6 具有相似的再照明，但 NIR-II 探针在肝脏中显示出较低的再照明百分比，其中更有可能发生再照明（图4 D）。与 P2 相比，ACQ1 在所有易重照器官中的再照射百分比显着降低，表明其作为 ACQ NIR-II 探针的潜在应用。此外，体内和体外的肝脏复照比例几乎相同，表明它们在复照研究中的一致性（图4 E）。

结论

为了利用NIR-II成像的高时空分辨率和深度穿透性，在aza-BODIPY的3,5位（具有更大的取代基效应）处安装了高平面和电子富的julolidine，并构建了具有微调平面性和疏水性的类似物来开发NIR-II ACQ探针。新开发的探针在850 nm左右表现出强烈的吸收，摩尔消光系数为60,000–83,000 L/（mol·cm），在950–1300 nm区域发出明亮的荧光，量子产率为1.50%–5.23%，甚至在1300 nm以上的区域表现出明显的荧光信号。与 P2 相比，3,5-julolidinyl 探针在等离子体和 1% 吐温中的复照显着降低。ACQ1 和 ACQ6 在 40% 水下表现出更高的水敏感性和淬灭稳定性，孵育 24 小时后在等离子体中的荧光回收率低于 2.0%。此外，可生物降解 PM 的体内生物分布表明，肝脏区域重新照明的 ACQ1 的伪影最小，值小于 2.5%，与观察到的 P2 的近 15% 相比显着降低。离体成像评估也验证了ACQ1的低伪影。