本文要点:将分子成像扩展到短波红外(SWIR,900-1400 nm)区域,可以对生命系统中的生物分子进行深层组织可视化。目前只有吲哚菁绿(ICG)及其类似物被批准用于生物医学应用,但小于 800 nm 的激发波长限制了这些探针的深层组织穿透和非侵入性荧光成像。在此,介绍了基于ICG的π共轭延伸花青染料,合成ICG-C9和ICG-C11作为生物相容性,以及发射波长分别为922和1010 nm的水溶性SWIR发射探针。此外,还合成了基于 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 的荧光标记剂,用于开发 SWIR 分子成像探针。使用 ICG、ICG-C9 和ICG-C11,通过可视化活小鼠的表面受体(EGFR 和HER2)和肿瘤脉管系统来演示乳腺肿瘤的三色 SWIR 荧光成像。此外,本研究展示了使用 ICG 偶联的抗癌药物 Kadcyla 和 ICG-C9 或 ICG-C11 偶联膜联蛋白 V 对乳腺肿瘤凋亡进行双色 SWIR 荧光成像。最后,我们展示了Kadcyla诱导的乳腺肿瘤缩小的长期(38天)SWIR荧光成像。本研究为使用生物相容性和水溶性SWIR发射探针进行多重荧光分子成像提供了一般策略。
然而,当ICG用作SWIR荧光团时,其激发波长被限制在800nm以下。对于多路复用SWIR荧光成像,需要具有更长激发和发射波长的ICG类似物。增加花青染料聚亚甲基链中一个双键的长度有助于将其吸收和发射最大染料转移到大约 100 nm 的波长。因此,我们合成了π共轭扩展的ICG类似物ICG-C9和ICG-C11,它们在水相中的发射波长分别以922和1010nm。此外,基于 ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 合成了SWIR 荧光标记剂,用于 SWIR 区域的多色荧光分子成像。尽管在合成SWIR荧光探针方面付出了巨大努力,但适用于生物医学研究的多路SWIR荧光分子成像技术尚未完全建立。本研究旨在提出一种可用于生物医学应用的多路复用SWIR分子成像的通用策略。使用与 ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 的抗体偶联物,我们通过可视化表面受体(表皮生长因子受体 (EGFR))来演示乳腺肿瘤的多重 SWIR 荧光分子成像和人表皮生长因子受体 2 (HER2)和活小鼠的肿瘤脉管系统。此外,本文演示了使用 ICG 偶联的 Kadcyla(曲妥珠单抗 emtansine)对肿瘤凋亡进行多路 SWIR 荧光成像和 ICG-C9(或 ICG-C11)偶联膜联蛋白 V。最后,我们展示了使用 ICG-C9 偶联的 Kadcyla 的 SWIR 荧光对乳腺肿瘤缩小进行长期(38 天)成像。通过展示SWIR荧光分子成像,我们的研究结果表明,ICG和基于ICG的π共轭延伸的花青染料应该是生物医学应用的标准SWIR荧光团。
图1. ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 的光学特性
图2. 合成 SWIR 荧光标记剂、N-羟基琥珀酰亚胺酯 (NHS)、马来酰亚胺和 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 的炔烃衍生物
作为SWIR荧光标记剂,我们合成了ICG、ICG-C9和ICG-C11的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、马来酰亚胺和炔烃衍生物(图2a,支持信息,方案S4-S10)。(6,43)与ICG、ICG-C9和ICG-C11偶联抗体的制备方法如图2b所示。合成SWIR荧光标记剂的详细方案和程序在支持信息中进行了描述。虽然荧光标记剂ICG-NHS,(43)ICG-马来酰亚胺和ICG-炔烃是市售的,其表征尚未报道。在这里,我们描述了ICG-马来酰亚胺和ICG-炔烃的合成和表征(支持信息,方案S4和S5)以及ICG-C9和ICG-C11的马来酰亚胺和炔烃衍生物。荧光标记剂ICG-C9-NHS是通过化合物6和NHS之间的酯化反应获得的(支持信息,方案S6)。化合物6与1-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐与丙炔胺的缩合反应分别得到ICG-C9-马来酰亚胺和ICG-C9-炔烃(支持信息,方案S7和方案S8)。类似的缩合反应用于合成ICG-C11-马来酰亚胺和ICG-C11-炔烃。
本文使用 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 的 NHS、马来酰亚胺和炔烃衍生物对抗体分子进行 SWIR 荧光标记(图 2b)。NHS衍生物用于标记整个抗体分子中的氨基。马来酰亚胺衍生物用于标记还原抗体分子中的巯基。最后,利用炔烃衍生物基于点击化学标记抗体分子,其中叠氮化物基团被引入抗体分子中(图2b)。SWIR染料抗体(赫赛汀)偶联物的吸收和荧光光谱如图2c所示。ICG-Ab、ICG-C9-Ab和 ICG-C11-Ab(Ab:赫赛汀)分别在 820、921 和 1039 nm 处观察到最大荧光。根据SWIR花青染料的消光系数,ICG-Ab、ICG-C9-Ab和ICG-C11-Ab的抗体/SWIR染料标记率分别为0.5、0.8和1.1。ICG、ICG-C9 和 ICG-C11在水中的最大摩尔消光系数为14.7×104, 9.55 × 104和 5.48 × 104M–1cm–1。与 ICG-Ab 和 ICG-C9-Ab 相比,ICG-C11-Ab 的标记率更高可能是由于 ICG-C11 的疏水性更高,导致 SWIR 染料对抗体分子的可及性增加。
此外,使用由 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 的马来酰亚胺和炔烃衍生物制备的 SWIR 染料-Erbitux偶联物对携带乳腺肿瘤的小鼠进行了 SWIR 荧光成像。与注射SWIR染料-NHS-Erbitux偶联物的小鼠一样,在注射SWIR染料-(马来酰亚胺或炔烃)-偶联的Erbitux的小鼠中观察到来自乳腺肿瘤的显着SWIR荧光发射(图3c,d)。这些结果还支持 SWIR 染料-(马来酰亚胺或炔烃)偶联的 Erbitux 在 EGFR 阳性乳腺肿瘤 (MDA-MB-468) 中的积累。
图4. 乳腺肿瘤的多重SWIR荧光分子成像
图5. 肿瘤凋亡的SWIR荧光成像
图6. ICG-C9-Kadcyla诱导的乳腺肿瘤缩小的长期SWIR荧光成像
最后,本文研究了花青染料的SWIR荧光是否可用于体内肿瘤凋亡的长期成像。为了监测抗肿瘤药物Kadcyla诱导的肿瘤凋亡,我们通过用ICG-C9-NHS标记Kadcyla来制备ICG-C9偶联的Kadcyla(ICG-C9-Kadcyla)。在注射ICG-C9-Kadcyla的乳腺肿瘤(KPL-4)小鼠中进行长期SWIR荧光成像。在ICG-C9-Kadcyla注射后2-38天采集SWIR荧光图像(图6a)。注射Kadcyla后约1个月,乳腺肿瘤的大小减小了12倍(图6b,c),表明Kadcyla诱导的肿瘤缩小显著。此前,我们报道了使用 ICG-赫赛汀和 ICG-C11-膜联蛋白 V 分别对肿瘤凋亡进行 9 天和 15天的长期成像。目前使用ICG-C9-Kadcyla的结果,加上早期报道的结果,表明ICG-C9的SWIR荧光发射以及ICG和ICG-C11的SWIR荧光发射适用于活小鼠肿瘤凋亡的长期成像。
结论
本文开发了π共轭延伸的花青染料,ICG-C9和ICG-C11。SWIR成像技术的重要特点是使用在SWIR区域发射的生物相容性和水溶性花青染料ICG-9和ICG-C11。ICG-9 和 ICG-C11 可以在大约 900 和1000 nm 处激发,从而实现多色 SWIR 荧光成像。使用ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 的抗体偶联物,我们展示了 HER2 阳性和 EGFR 阳性荷瘤小鼠表面受体和肿瘤脉管系统的多路 SWIR 荧光成像。此外,还展示了抗癌药物Kadcyla诱导的乳腺肿瘤缩小的长期(38天)SWIR荧光成像。
参考文献
Swamy M M M, Murai Y, Monde K, et al. Biocompatible and Water-Soluble Shortwave-Infrared (SWIR)-Emitting Cyanine-Based Fluorescent Probes for In Vivo Multiplexed Molecular Imaging[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2024, 16(14): 17253-17266.
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