资料摘要
资料下载细胞株的误识别或污染,将对实验结果有很大的影响。 因此,推荐定期实施细胞株鉴定(Cell Line Authentication: CLA),并确认无外来细胞的混入或置换。 在CLA中,广泛使用对STR(Short Tandem Repeat)进行分析的方法。 STR是散布在基因组中的以2-7个碱基短串联重复序列。 不同个体间的STR的重复次数(等位基因)各不相同,因此STR是DNA鉴定中很有用的标记。 在CLA中首先用PCR扩增多个STR后,通过毛细管电泳鉴定每个等位基因。 然后,将已鉴定的等位基因与在ATCC(American Type Culture Collection)等生物资源中心注册的各个的等位基因(以下,标记为参考等位基因)相比较而鉴定细胞株(1)。 此时,为了获取高可靠性的结果,仪器需要具有高分析性能。 在此,介绍使用DS3000 Compact CE Sequencer (以下简称DS3000)时的CLA实例。 用GenePrint® 10 System与GenePrint® 24 System (Promega®)验证的结果,以DS3000获取的等位基因与参考等位基因的一致程度为大于等于80%时,将其判断为相同细胞(2)。 由此可知,DS3000具有可进行CLA的分析性能。
使用了DS3000 Compact CE Sequencer的短DNA的读取精度的提高
简介:在Sanger测序中,时有在开始读取的区域中无法获得峰波形,或者出现读取错误的情况。这是由于填充在毛细管中的电泳介质 (聚合物) 有无法正确检测,分离短DNA的情况。此实验是使用DS3000 Compact CE Sequencer,提高了开始读取区域的数据质量1的示例。为了改善,使用了加尾引物。尾部是添加到测序引物5’末端的任意碱基序列。由于尾部可延长反应产物,因此可通过电泳分离。当添加40个碱基至尾部时,可从测序引物的3’末端下游第1个碱基的DNA开始无错误地读取。另一方面,显示出读取碱基的长度缩短了相当于尾部的长度。在添加尾部时,请参考本报告,事先确认必要的分析区间。
使用DS3000 Compact CE Sequencer的GC-rich序列的解析实例
简介:富含鸟嘌呤 (G) 与胞嘧啶 (C) 的序列 (GC-rich序列) 通常多出现在转录调控区域等的基因 组上功能重要的位置。在GC-rich序列中,时有发生聚合酶的延伸反应被阻碍,而在PCR与循环测序反应中,导致无法获得目标产物的情况。可以考虑到的原因是由于鸟嘌呤-胞嘧啶形成比腺嘌呤-胸腺嘧啶更稳定的碱基对,所以双链DNA不能很好地被解链。因此,可添加促进DNA解链的添加剂 (PCR添加剂)。代表性的PCR添加剂有甲酰胺 (FA) 与甜菜碱 。 在此实验中,使用GC-rich序列,针对FA与甜菜碱的浓度及添加时间进行了研究。结果是,通过添加PCR添加剂,即使在GC含量高于70%的情况下,也可获得PCR产物。另一方面,在循环测序中如果添加PCR添加剂,不仅会降低信号强度,还会在波形数据中混入干扰峰,碱基的错误读取 (读取错误) 也有所增加。
使用DS3000 Compact CE Sequencer新功能进行SNaPshot TM分析
简介:DS3000 Compact CE Sequencer(DS3000)已添加新功能。 使用新型DS3000,可以单 独设定用于分析的荧光染料和Size Standard Protocol,并可以使用更多种试剂盒。 为了验证新功能,使用旧型DS3000不支持的的荧光染料组合,实施SNaPshotTM (Thermo Fisher Scientific)。 SNaPshotTM是一种利用单碱基的延伸反应,同时鉴定与引物邻接的碱基的技术。 通过改变各反应产物的泳动速度,可以同时检测多个SNP。 在本次实验中,利用DS3000的新功能,可一次性检测了6个SNP。
DS3000 Compact CE Sequencer上GlobalFiler TM Express PCR Amplification Kit的性能
简介:GlobalFilerTM Express PCR Amplification Kit (Applied BiosystemsTM)是常用于DNA分析的试剂包之一,可通过单一/多重PCR扩增包括European Standard Set和CODIS (Combined DNA Index System) 推荐的基因座集的24个标记。本报告检测出从DS3000 Compact CE Sequencer上的GlobalFilerTM Express PCR Amplification Kit中获得的样 品的数据质量。通过分析灵敏度、精度、重复性,得出了DS3000 Compact CE Sequencer的性能满足使用GlobalFilerTM Express PCR Amplification Kit实现DNA分析的结论。
用DS3000 Compact CE Sequencer 检查下一代测序分析数据
简介:在下一代测序分析中检测出的基因组上的突变(以下简称NGS),由于分析的简便性,通过Sanger测序可以检测出来(参考文献(1)。在此,介绍用 DS3000 Compact CE Sequencer以下简称DS3000)、进行NGS变体分析的实例。最初,通过从人类结肠癌细胞株(HCT116)中提取的基因组DNA,对12个单碱基替换进行了分析。DS3000的碱基识别程序可以检测出所有单碱基替换。此外,通过用Mutation Surveyor ver. 5.1.2, SoftGenetics公司)分析在DS3000中获取的波形数据,可以检测出突变率的定量、碱基的插入或缺失。 本仪器是研究专用仪器,并未获得基于药事法的医疗仪器的认证。因此,此仪器不可用于诊断。
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