拉曼光谱丨细菌免培养药敏检测新工具

在抗生素压力下，耐药菌的代谢活性远高于敏感菌。通过向培养环境中添加重水（D₂O），对抗生素胁迫下的活性微生物群体进行标记，再利用拉曼光谱在单细胞层面检测微生物群体中的同位素峰（C - D），从而确定微生物的药敏结果^[1]。

该方法基于免培养策略，可在 3 - 6 小时内得出结果。

     

生物拉曼光谱检测技术方案(一)丨生物拉曼在细胞耐药性/活力检测中应用

在重水与活性微生物孵育过程中，D₂O中的D元素可以通过一些途径被吸收转化到细胞内的生物质中。因此微生物体内的D积累情况可以反映出其活性，可利用拉曼光谱检测通过CD比值（CD ratio = CD/(CD+CH)）来表征。其中CH表示C-H 伸缩震动，体现在拉曼光谱中为2040-2300 cm^-1处的光谱峰，CD表示同位素替代的C-D震动，体现在拉曼光谱中为2800-3100 cm^-1处的光谱峰（Fig.1A）。

肉汤稀释法MIC的测定结果由肉眼确定，拉曼光谱法MIC由重水峰的决定（Fig.1B）。将大肠杆菌肉汤稀释法MIC结果与拉曼光谱MIC结果比较，如Fig.1C所示。大肠杆菌的MIC每种药物做了8个浓度梯度，每个梯度2倍稀释，图中绿色线框对应的浓度为肉汤稀释法检测得到的MIC，定义为肉眼可见澄清培养基的抗菌剂浓度。图中空白位置为未设置药物浓度梯度，橙色填充为Raman检测C-D峰的高于阈值，蓝色填充为Raman检测C-D峰低于阈值，对应的MIC值定为药物浓度从小到大顺序下，Raman检测平均值第一个小于阈值的抗菌剂浓度（Fig.1C红色线框）。由图Fig.1C可知，肉汤稀释法测得的MIC浓度与Raman-D₂O标记测得的MIC浓度基本一致，差异结果在左右一个梯度之内，该误差可以接受^[2]，因此表明基于拉曼光谱法的药敏检测具有可行性。

Fig1. 大肠杆菌（E.coli ATCC25922）不同药物药敏结果

A）单个重水标记微生物的拉曼光谱。其中横坐标为拉曼相对波数，纵坐标为相对强度。灰色色块对应的区域依次为C-D、C-H；B）以阿米卡星为例，大肠杆菌在不同浓度下的CD ratio分布。灰色虚线表示阈值，用于MIC判定；C）大肠杆菌对于不同药物Raman-D₂O法的MIC判定以及肉汤稀释法的MIC结果比较。其中红色线框表示Raman-MIC结果，绿色线框则表示肉汤稀释法结果；D）药物缩写对应药物名称及作用机制

[1] Yi, X. et al. Development of a Fast Raman-Assisted Antibiotic Susceptibility Test (FRAST) for the Antibiotic Resistance Analysis of Clinical Urine and Blood Samples. Anal. Chem. 93, 5098–5106 (2021).

[2] Jorgensen, J. H. & Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clin Infect Dis 49, 1749–1755 (2009).