α-淀粉酶活性检测试剂盒 微量法

α-淀粉酶（α-AL）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂一：若有黄色晶体析出，需加热溶解后再用；

2、 试剂二：临用前取 1 支试剂三加入 1 瓶试剂二中，置于常温水中并加热至煮沸，期间不断搅拌粉剂至溶解，用不完的试剂 2-8℃保存 4 周；

3、 标准品：10 mg 无水葡萄糖。临用前加 1 mL 蒸馏水，配成 10 mg/mL 葡萄糖标准液，2-8℃保存两周。

产品说明：

淀粉水解酶，包括 α-淀粉酶和 β-淀粉酶。α-AL (EC 3.2.1.1)随机催化淀粉中 α-1,4-糖苷键水解，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。

淀粉水解酶催化淀粉水解生成还原糖，还原糖还原 3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质，在 540nm 有吸收峰；通过测定 540nm 吸光度增加速率，计算淀粉酶活性。α-AL 耐热，但是 β-淀粉酶可在 70℃钝化 15min。因此粗酶液经过 70℃钝化 15min，就只有 α-AL 能够催化淀粉水解。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

酶标仪/可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、96 孔板/微量玻璃比色皿、研钵/匀浆器和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

称取约 0.1g 样本，加 0.8mL 蒸馏水匀浆；匀浆后在室温下放置提取 15min，每隔 5min 振荡 1 次，使其充分提取；6000g，室温离心 10min，吸取上清液并且加蒸馏水定容至 10mL，摇匀，即为淀粉酶原液。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540 nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 标准液的稀释：将葡萄糖标准液用蒸馏水稀释为 0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078mg/mL 的标准溶液。

3、 标准液稀释可参考下表：

备注：实验中每个标准管需 75μL 标准溶液。

4、 对照管样本处理：取 250μL 样本沸水浴 5min 作为对照管使用。

5、 按照操作表依次加入各个试剂：

混匀，沸水浴 10min，取 200μL 至 96 孔板或微量比色皿中，540nm 处读取吸光度，分别记为 A 对照、A 测定、A标准和 A 空白，计算 ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA 标准=A 标准-A 空白。每个测定管需设一个对照管。标准曲线和空白管只需测 1-2 次。

三、α-淀粉酶活性计算

1、 标准曲线的绘制：

以标准液的浓度（mg/mL）为 x 轴，对应的 ΔA 标准为 y 轴绘制标准曲线，得到标准方程 y=kx+b，将 ΔA 测定代入方程中计算得到样本浓度（x，mg/mL）。

2、α-淀粉酶活性的计算：

（1）按照样本质量计算

单位定义：每g 组织每分钟催化产生1mg 还原糖定义为1个酶活力单位。

α-淀粉酶活性(U/g 质量)=x×V样÷(W×V样÷V 样总)÷T=2×x÷W

（2）按照蛋白质浓度计算

单位定义：每mg 组织蛋白每分钟催化产生1mg 还原糖定义为1个酶活性单位。

α-淀粉酶活性(U/mg prot)= x×V样÷（V样×Cpr）÷T=0.2×x÷Cpr

V样：加入反应体系中样本体积，0.075mL；V样总：提取液总体积，10mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；T：反应时间，5min。

注意事项：

测定的吸光值大于 1.5 时，可以对样本进行适当稀释后测定。若吸光值过小，可以浓缩淀粉酶稀释液或者淀粉酶原液。注意同步修改计算公式。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！