供货周期: | 7天 |
品牌: | 博尔森 |
型号: | 100T/48S |
货号: | BES-2661BTK |
血清淀粉酶(AMY)活性检测试剂盒(碘-淀粉比色法)说明书
微量法
规格: 100T/48S
产品内容:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂一:临用前加入 12.5mL 试剂二,置于常温水中并加热至煮沸,期间不断搅拌粉剂至溶解;用不完的试剂 2-8℃保存 1 个月。
2、 试剂三的配制:将试剂三 A 倒入试剂三 B 中,用蒸馏水定容至 10mL,2-8℃避光保存一个月。
3、 标准品:10mg 淀粉标准品。临用前加 10mL 试剂二,置于常温水中并加热至煮沸,配成 1mg/mL 淀粉标准液。用不完的试剂 2-8℃保存 1 个月。
血清淀粉酶( Serum amylase, AMY) 属于 α-淀粉酶,以无规则方式水解多糖分子内部的 α-1,4 糖苷键,生成寡聚糖、麦芽糖和葡萄糖的混合物。AMY 主要由唾液腺和胰腺分泌,另外近端十二指肠、肺、子宫、泌乳期的乳腺等器官也有少量分泌。
AMY 催化淀粉分子中的 α-1,4 糖苷键水解,产生葡萄糖、麦芽糖以及糊精等,碘可以与未被水解的淀粉结合,生成在 570nm 下有特征吸收峰的复合物,其深浅可计算出淀粉酶的活力单位。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
酶标仪/可见分光光度计、恒温水浴锅/培养箱、台式离心机、可调式移液器、96 孔板/微量玻璃比色皿、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤:
一、粗酶液提取
取 40μL 血清和 160μL 蒸馏水混合(即将血清稀释 5 倍),分为 2 管 100μL 分别作为测定管和对照管。若实验后所测数值偏大或者偏小,可以调整稀释比例(比如数值偏小可以将 80μL 血清和 120μL 蒸馏水混合即将血清稀释 2.5 倍)
二、测定步骤和加样表
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长到 570 nm,蒸馏水调零。
2、 将淀粉标准液用蒸馏水稀释为 0.5、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL 的标准溶液。
3、 按操作表依次加入各试剂:
混匀后吸取 200μL 于微量玻璃比色皿或者 96 孔板中,于 15min 内读取测定管、对照管、空白管 1、标准管、空白管 2 在 570nm 下的吸光度,分别记为 A 测定、A 对照、A 空白 1、A 标准和 A 空白 2,计算 ΔA 测定=(A空白 1-A 空白 2)-(A 测定-A 对照),ΔA 标准=A 标准-A 空白 2。
三、AMY 活性计算
1、 标准曲线的绘制
以 ΔA 标准为 y 轴,以标准溶液浓度为 x 轴,绘制标准曲线,得到方程 y=kx+b。将 ΔA 测定带入方程得到 x(mg/mL)。
2、按照血清体积计算:
单位定义:每mL血清每分钟消耗1mg淀粉定义为1个酶活性单位。
AMY活性 (U/mL)= x×V样÷V样÷T×F =0.1×x×F
V样:加入反应体系中样本体积,0.1mL;T:反应时间,10min;F:稀释倍数。
1. ΔA 测定大于 1.5 时,可以对样本进行适当稀释后测定。
2. 反应完成后需在 15min 内测定吸光度。
1、 取 40μL 牛血清和 160μL 蒸馏水混合(即血清稀释 5 倍)后,按照测定步骤操作,用 96 孔板测得计算 ΔA 测定= A 空白-(A 测定-A 对照)=(1.409-0.067)-(1.297-0.058)=0.103,带入标准曲线 y=2.6047x-0.0165,计算 x=0.0459,按公式计算活性:
AMY(U/mL)= x×V 样÷V 样÷T=0.1×x×F=0.1×x×F =0.0230 U/ mL。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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