干货！掌握关键技巧，成为化学发光Western大牛！

Azure中国

2023/11/02 11:25

基于化学发光的western blot 实验技术是目前蛋白质检测的主流方法。此技术的实验原理是样品特异性结合一抗和HRP酶联二抗后，加入化学发光底物，酶催化底物发光。在发光检测环节中，传统方法使用压片（x光片）检测，随着科技的发展，目前主要使用数字化成像系统（如chemiSOLO化学发光成像仪）进行成像检测。

化学发光western blot 方法的优势是高达fg 级的检测灵敏度，是确定目的蛋白表达与否的比较常规的定性检测，可用于检测外源蛋白的诱导表达，确认纯化的某种已知蛋白，或进行抗体的验证等。

化学发光western blot示意图

化学发光western blot实验操作流程较为复杂，需要优化的点也非常多。其中，高背景就是困扰广大科研工作者最常见的问题之一：如整体的高背景将目的蛋白信号淹没；亮点、斑块随机散布在印迹膜上。那么，如何获得目的蛋白低背景、高信号强度（高信噪比）的检测结果呢？

答案来了！

化学发光western 完美实验的关键技巧：

优化蛋白上样量。可进行梯度稀释，确定最佳上样量，也可保证成像仪获取最佳成像数据。

选择合适的印迹膜，根据不同实验需求可选择NC膜和PVDF膜。

保持洁净，使用前对托盘等设备进行清洗，戴手套处理凝胶，用镊子处理膜等。

确认所有的buffer都混合均匀，尤其是封闭液和抗体孵育buffer，若混合不均匀，极易引起高背景，buffer最好过滤后使用。

如果背景较高，可使用大剂量的洗涤buffer清洗或者增加洗膜的间隔时间和次数。

尝试使用不同的封闭液，某些抗体可能会与封闭液反应引起高背景，某些封闭液可能阻碍抗体和目的蛋白的结合，脱脂牛奶和牛血清白蛋白BSA是最常用的印迹膜封闭液，封闭液可用作一抗的稀释液，减少非特异性条带的出现。

可采用点杂交的方法摸索一抗和二抗的最佳稀释比例，能较好的降低背景。
不要使用带有叠氮化钠的抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体，因为叠氮化钠会抑制HRP 的活性。

使用足够多的底物，确认印迹膜孵育均匀。

尝试使用不同底物增加灵敏度和信号持续时间，不同底物适用于不同印迹膜的检测，有的适用低丰度蛋白，有的适合高丰度蛋白；不同底物具有不同反应时间和持续时间，从而影响成像效果。

为增加酶活性，化学发光底物使用前需在室温下进行平衡。

使用数字成像检测远优于胶片，数字成像的动态范围较宽，不易出现过饱和现象，且具有过饱和提示功能。

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Azure Biosystems成立于2013年，总部位于美国加州湾区，是一家致力于生命科学领域先进生物成像系统研发、制造、推广及服务一体的创新型公司。拥有分子成像领域近30年经验的卓越团队，Azure公司革新推出的Azure系列新一代多功能分子成像系统和Sapphire激光扫描成像系统已成为技术领先的特色产品。目前，公司已形成分子凝胶成像、Western Blot、RT-PCR及配套试剂耗材等产品线。

公司成像设备全球装机＞5000台，用户数量＞30000，包括美国最高科研机构NIH、梅约诊所、哈佛大学、中国科学院、清华大学、诺华制药等知名科研院所、医院及生物医药企业等。截至目前，发表文章＞3000篇，发表刊物包括Cell、Science、Nature三大期刊及子刊、JBC、JMC等国际著名期刊杂志。

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