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细胞外囊泡(EV)是直径约为30-10,000纳米的生物颗粒。细胞外囊泡包括具有广泛物理性质和生物学来源的各种类型的颗粒,如外泌体、核外颗粒体、微泡、微粒、癌体和凋亡小体。细胞外囊泡具有与同样广泛的生物过程相关的作用,包括免疫反应、功能蛋白和核酸的转移、消除不需要的物质、营养、表面受体介导的细胞信号传导以及包括癌症转移在内的许多疾病状况。细胞外囊泡作为健康和疾病的治疗剂和生物标志物具有巨大的潜力。随着细胞外囊泡(EV)在治疗和诊断方面的应用日益广泛,准确描述EV种群的大小和浓度变得越来越重要。扫描电子显微镜(SEM)技术经常被使用,但价格昂贵且速度慢。流式细胞术是准确的,但需要标记。基于光散射的技术便宜快速,但在测量低折射率对比度的颗粒时会失去灵敏度,产生误导性的结果。nCS1仪器基于微流体电阻脉冲传感(MRPS)技术,在快速可靠的分析平台上为EV粒径和浓度的测量提供了实用的解决方案。
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在本文中,将使用基于MRPS技术的nCS1与纳米颗粒跟踪分析(NTA)和扫描电子显微镜(SEM)的测量结果进行比较。我们选择两种样品来演示和验证。
样品1:某种蛋白质制剂:样品浓度为5毫克/毫升,并在测量前施加压力以产生聚集。蛋白质聚集产生浓度相对于颗粒大小的自然幂律分布,这在文献中有很好的记录。
当蛋白质发生聚集时,它自然倾向于产生浓度与颗粒大小之间的幂函数分布。单体变成二聚体,然后变成三聚体,以此类推,形成更大的低聚物,最终形成聚合物。下图显示了使用NTA和MRPS测量应激蛋白治疗的结果。MRPS结果表明,对于所使用的芯片(TS-400),其检测限(LOD)为65 nm,符合幂定律关系。
NTA的结果显示,在本该平滑的路径上出现了虚假的伪影。更重要的是,NTA的结果也显示了一个明显的灵敏度衰减,从250纳米开始,NTA中较大粒子的信号完全盖过了较小粒子产生的较暗信号。尽管理论上,NTA系统规范表明它应该能够正确地量化远小于250纳米的颗粒,但在实践中,由于较大颗粒的存在,它无法做到这一点。
样品2:参考外泌体样品,先前通过SEM表征。
下图显示了nCS1与NTA和黄金标准SEM的比较。nCS1测量结果与SEM的测量结果非常吻合,表明外泌体的粒径小至50 nm。相比之下,NTA报告了误导性的结果,外泌体尺寸分布中接近130nm直径的突出峰,实际上并不存在。并从200nm开始,灵敏度显著衰减,在65nm处浓度误差达10000倍。
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上面两项研究表明,与MRPS和SEM相比,NTA测量容易在EV分布中报告假峰。当样品中存在多分散混合物颗粒时,它会误报颗粒分布中的峰值,而事实上并不存在这样的峰值。原因在于NTA的工作方式。对于小于几百纳米的粒子,瑞利散射决定了用于监测移动纳米粒子的散射光的强度。这种强度与照明波长的四次方成反比,但更重要的是,它与粒子直径的六次方成正比。这可以从散射截面公式中看出:
式中n是粒子的折射率; 请注意,如果n接近于1,就像生物粒子一样,截面可以变得非常小。散射光强度不直接提供直径测量; 而是从粒子的布朗运动中提取出来的,这使得提取粒子的流体动力学半径成为可能。
由于与直径的六次方的关系,大颗粒散射的光强远高于小颗粒散射的光强。NTA因此会错过暗淡得多的小颗粒,从而错误地报告小颗粒与大颗粒的相对丰度。
这一效应已在发表过的文献1中报道过,下图改编自参考文献1,显示了这如何影响测量到的颗粒分布,其中蓝色曲线显示了真实的颗粒分布,橙色曲线显示了NTA可能报告的结果,假设NTA过度报告了与它们的散射截面成比例的较大颗粒。这在分布中产生了一个假峰,由于强度随着直径的增加而增加,直到更大直径的颗粒浓度下降压倒了这种效应。
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