实验方案：微滴/微球制备仪制备PLGA微球

实验目的

本实验方案通过利用微滴/微球制备仪，以2% PVA水溶液为水相，以5% PLGA-二氯甲烷溶液为油相制备高单分散的微滴，并在水相接收液中挥发微滴中的二氯甲烷溶剂，实现微滴的固化，最终获得具有极高的单分散性的PLGA微球(CV<5%)。

引言

药物递送系统（DDS）是一种用可持续方式向特定部位输送药物的系统，旨在通过调节最佳剂量以达到治疗疾病或减轻痛苦的作用^[1]。其中，PLGA（羟基乙酸共聚物）因其优越的生物相容性和生物可降解性^[1,2,3,4]，在药物递送、生物传感、组织工程等领域有广泛应用^[2]。在生物体内，PLGA可降解为水和二氧化碳等无毒小分子，通过Krebs循环排出^[1]。作为一种药物载体，这种共聚物近年来吸引了越来越多的关注，目前已有多种含PLGA的药物上市^[3,4]。一般来说，PLGA是由乳酸和羟基乙酸在催化条件下共聚而得，兼具两种化合物的性质特征，通过调节两种单体化合物的比例，即可改变共聚物的性质^[1]。因此，对化疗药物、抗菌消炎和抗老化药物等药物递送系统而言，PLGA是一种理想的材料^[1]。

制备PLGA微球的传统方法有溶剂挥发法、凝聚和喷雾干燥法^[1,3]，然而通过这些方法制备出的PLGA微球往往具有较宽的尺寸分布，批次间稳定性较差，药物包封效果也不尽如人意^[3]。在实际应用中，PLGA微球的尺寸的药物释放效果有至关重要的作用，单分散性不佳的载药PLGA往往会出现初始迸发释药现象，严重影响药物治疗的效果，甚至可能产生毒性^[4]。因此，开发一种可重复、粒径及均匀度可控的PLGA微球制备技术是其成功应用的必要条件。

基于此，FluidicLab微滴制备平台运用液滴微流控技术，将PLGA溶解在二氯甲烷中，以PLGA-二氯甲烷溶液为油相，聚乙烯醇（PVA）水溶液为水相，通过微滴/微球制备仪制备高度均一的PLGA-二氯甲烷微滴，在室温下挥发微滴中的二氯甲烷溶剂，最终得到PLGA微球。该法操作简便，样品利用率高，制备得到的微球单分散性高(CV<5%)，具有较好重复性。

实验材料

实验步骤

1、试剂准备

(1)、2% 聚乙烯醇(PVA)水溶液(w/v)配制

称取0.2 g PVA粉末，加入超纯水震荡，放入85℃水浴锅中搅拌加热溶解,*终定容至10 mL。用0.22 μm滤膜过滤。

(2)、5% PLGA-二氯甲烷溶液(w/w)配制

称取0.1 g PLGA粉末，加入1.43 mL 二氯甲烷(约1.9 g)，超声溶解。用0.22 μm滤膜过滤。

2、微滴制备：

（1）微滴/微球制备仪的安装连接

微滴/微球制备仪安装连接参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“2. 微滴/微球制备仪的安装连接”的部分；其连接如下(步骤③-⑦连接效果如下图所示)：

① 用气管依次连接“空气压缩机”--“气源处理装置”--“微滴/微球制备仪”；

② 将微滴/微球制备仪分别与电源、电脑的连接；

③ 用气管分别将A0(压力输出通道一)和A1(水相15 mL储液池)，B0(压力输出通道二)和B1(油相1.5 mL黑色离心管储液池)连接；

④ 用配有1/4-28螺纹接头和卡箍的PEEK管(内/外径 0.25 mm/1.6 mm)分别将A1(水相15 mL储液池)和A2(通道一流量传感器)，B1(油相1.5 mL黑色离心管储液池)和B2(通道二流量传感器)连接；

⑤ 用配有1/4-28螺纹接头和卡箍的PEEK管(内/外径 0.25 mm/1.6 mm)分别将A2(通道一流量传感器)和A3(玻璃芯片的水相入口)，B2(通道二流量传感器)和B3(玻璃芯片的油相入口)连接；

⑥ C为标准玻璃芯片和夹具的组合，芯片和夹具的入口通过硅胶塞密封；

⑦ 用PEEK管(内/外径 0.25 mm/1.6 mm)将芯片出口D处生成的乳液导出。

（2）FluidicLabSuite软件的安装和设备的添加：

FluidicLabSuite软件的安装参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“3.1 FluidicLabSuite软件的安装”的部分；

（3）PLGA微液滴的制备

具体操作步骤如下：

① 分别在15 mL水相储液池(通道一)和1.5 mL油相黑色离心管储液池(通道二)中依次加入5 mL 2% PVA水溶液和1 mL 5% PLGA-二氯甲烷溶液；

② FluidicLabSuite软件的设备添加参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“3.2 FluidicLabSuite软件的设备添加”的部分(相机和流量传感器仅需添加一次)；

③ 打开空气压缩机和气源处理装置开关；

④ 在乳液出口端放置离心管接收微滴稳定前的废液；

⑤ 在电脑端设置通道一压力(水相，如250 mbar)和通道二压力(油相，如150 mbar)排出管路和芯片中的空气；

⑥ 待管路和芯片中完全填充液体后(空气被完全排出)；将整个系统由压力控制切换到流速控制，并设置通道一(水相)和通道二(油相)流速分别为14和3 μL/min；

⑦ 调整反馈值(Feedback)快速达到设定流速，并实现流速的稳定输出；

⑧ 用载玻片接收一滴乳液，并在普通光学显微镜下观察其微滴的均匀性；

⑨ 待微滴生成均匀后，即可开始接收至装有2% PVA水溶液的玻璃培养皿中；

⑩ 60 min后停止收集，随后静置一段时间，待二氯甲烷挥发完全。（注意：玻璃培养皿中的水溶液不能挥发干）

3、PLGA微球的清洗：

具体操作步骤如下：

① 将固化后的PLGA微球转移至1.5 mL离心管中；

② 2500 rpm离心处理1 min，并取出上部水溶液；

③按V球：V水=1:2 加入超纯水，振荡；

④2500 rpm离心处理1 min，并取出上部水溶液；

⑤重复上述③和④操作；

⑥*终得到固化后的PLGA微球。

4.、微滴/微球制备仪清洗：

微滴生成仪每次使用完必须清洗管路、流量传感器和芯片。具体操作详见“微滴/微球制备仪操作指导卡”。

结果与讨论：

刚接收的微滴平均粒径为62.76 μm，具有*高的单分散性(变异系数: CV=2.79%)。其显微镜图和粒径分布如下图所示：

*终获得的PLGA微球平均粒径为26.62 μm，具有*高的单分散性(变异系数: CV=1.07%)。其显微镜图和粒径分布如下图所示：

实验关键要点：

1、采用本方案制备PLGA微球时，液体在通入芯片前必须用0.22 μm或0.45 μm的滤膜过滤，避免芯片堵塞影响微滴生成；

2、采用本方案制备PLGA微球时，因二氯甲烷见光易分解，产生气泡影响液滴生成稳定性，油相溶液容器须避光，建议使用黑色不透光离心管，或用铝箔纸包裹；

3、采用本方案制备PLGA微球时，建议在载玻片上接收一滴稳定后的乳液，并观察其粒径变化，以确定完全固化后PLGA微球的粒径；

4、采用本方案制备PLGA微球时，固化过程中必须保证培养皿中始终有水溶液，避免水溶液挥发干后PVA固体粘附在PLGA微球上；

5、采用本方案制备PLGA微球时，固化前后微球粒径差异与PLGA油相溶液的浓度有关，接收液滴大小相同时，PLGA浓度越大，固化后的微球粒径越大。

参考文献：

[1] Rezvantalab S., et al. Microfluidic assisted synthesis of PLGA drug delivery systems, RSC Adv, 9, 2055 (2019)

[2] Lagreca, E., et al. Recent advances in the formulation of PLGA microparticles for controlled drug delivery. Prog Biomater, 9, 153–174 (2020)

[3] Montazeri L., et al. Modification of PDMS to fabricate PLGA microparticles by a double emulsion method in a single microfluidic device, Lab Chip, 16, 2596 (2016)

[4] Yoo J., et al. Phenomenology of the Initial Burst Release of Drugs from PLGA Microparticles, ACS Biomater. Sci. Eng, 6, 6053-6062 (2020)