实验方案：微流控混合方式制备盐酸多柔比星脂质体（Doxorubicin-Liposome）

脂质体（Liposome）是最先被广泛研究的纳米颗粒之一，是一种磷脂双分子层囊泡。由于其结构类似于生物膜的主要结构磷脂双分子层，故脂质体也被称为“人工生物膜”。脂质体的主要成分一般由磷脂与胆固醇构成，都是生物体内的内源性物质，几乎没有免疫原性。具有低毒性/高生物相容性等特点，被广泛用于药物的递送。

实验步骤：

为方便称量，可先行配置总浓度200 mM的脂质溶液母液，可使用60℃的水浴加热帮助溶解。根据后续实验的需求，再对母液进行稀释。室温下200mM的母液会逐渐析出，请溶解后尽快稀释配置工作液，或发现析出后再次加热助溶。

2.配置硫酸铵缓冲液

称取1.9812 g硫酸铵（分子量：132.14），使用超纯水定容至50 mL，得到300 mM的硫酸铵缓冲液50 mL。硫酸铵缓冲液与无水乙醇配置的脂质溶液需要分别使用0.22 μm的MCE滤膜与0.22μm的PTFE滤膜过滤，确保终产物中不含微小固态颗粒或杂质。

3.微流控合成

智能纳米颗粒合成仪操作界面如下：

对于仪器的使用方法，请参照我司智能纳米颗粒合成仪的操作指导视频(https://www.bilibili.com/video/BV1Kg4y127tc?share_source=copy_web)，或我司官网发布的LNP合成的实验方案https://www.fluidiclab.com/mrna-lnp-s1/)。经测试，我们发现不同总脂质浓度、总流速、流速比等条件都会对脂质体的合成粒径、PDI产生影响。

具体来说，该配方下，随着总脂质浓度升高，合成的脂质体粒径先下降后上升。在80mM浓度及以上合成的脂质体中，PDI显著升高。其影响的具体参数见【附录-附件1】。对于微流控参数条件进行测试，我们也发现其受到流速与流速比的影响。配方和实验参数经优化，结果为：使用15 mM浓度的脂质溶液（附录-附件1），总流速为16 mL/min（附录-附件2）；流速比为1：4（附录-附件3），可获得该配方下，粒径最小且均匀的脂质体。

4.粒径和PDI的检测

合成的脂质体可以使用动态光散射仪测定粒径与均一度。正常结果如下图所示：

由于脂质体初产物中含20%的乙醇，高浓度乙醇会使检测初产物的粒径有80%以上的偏差。因此需要及时将初产物稀释进行检测。

经测试，我们推荐的稀释方式是使用硫酸铵缓冲液将乙醇浓度稀释至2.5%（8倍稀释）。稀释浓度的确定过程参考附录-附件4。也可参考我司LNP合成方案中，附录3的稀释实验结论，其原理一致。

备注：Liposome初产物中高浓度乙醇会造成脂质体融合，需尽快（10 min内）将产物置于透析袋和透析液中透析。

5.DOX的包封

称取4.5g NaCl，使用超纯水定容至500 mL，配成质量浓度为0.9 %的NaCl。使用该缓冲液将DOX配置为10 mg/mL母液。

1.合成后的脂质体初产物用注射器直接移入透析卡（推荐使用Thermo的Slide-A-Lyzer^TM透析盒，20 K MWCO）或20 kDa预处理过的透析袋。

2.将装有脂质体初产物的透析卡或透析袋置于至少50倍体积的0.9% NaCl缓冲液中，室温透析至少6h。中途进行一次换液。

3.透析后的脂质体产物可以4 ℃保存。

1.选择适量DOX，加入透析完成的脂质体产物，并混合均匀。将溶液置于60 ℃水浴中共孵育30 min。

推荐的Drug：Lipid比例为1:5-10（mol:mol），已知DOX分子量为543.525 g/mol。以20 mM浓度的脂质溶液合成1 mL脂质体为例，

选择1:5的药脂比，药物的量为1 mL× 1/5 (1:4的流速比) × 20 mM × 1/5（1:5的药脂比）× 543.525 g/mol = 0.435 mg，即加入10 mg/mL DOX溶液435 μL。因此【推荐的DOX的量为435 μL-217 μL】

2.孵育完毕，将产物用注射器移入透析卡或透析袋中，置于至少50倍体积的0.9% NaCl缓冲液中，室温透析至少6h，中途换液2次。

3.透析后的DOX-Liposome可以在4 ℃保存

4.随后，可对该脂质体进行包封率的测量

实验方案：使用紫外分光光度计测定脂质体（Liposome）的包封率

离心管与枪头若干，

比色皿

Millipore 30 kDa 超滤离心管

实验仪器：

紫外分光光度计

实验步骤：

1.配置测试溶液

取45 mL异丙醇与5 mL浓度为75 mM的盐酸混合均匀备用标准曲线的测定

使用0.9% NaCl分别将DOX稀释至10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL。取100 μL不同浓度的DOX溶液与900 μL异丙醇-盐酸溶液混合，在波长480 nm下测定吸光度，将吸光度与DOX浓度绘制成标准曲线备用，我们测定的DOX-A480标准曲线见附录-附件5。

2.产物超滤

记录制备完成的DOX-Liposome的体积V0。使用30 kDa超滤管进行超滤并收集超滤后，超滤管中的液体（体积记为V2）与超滤下的液体（体积记为V1）。

该步骤有2个作用。一为对脂质体进行浓缩；

二为分离不含脂质体的外部缓冲液，方便后续确认未包封DOX的量。

3.包封率的测定

分别取100 μL上述液体与900 μL 异丙醇-盐酸溶液混合，在波长480 nm下测定吸光度，并代入标准曲线中，超滤下的液体的吸光度记为A1，超滤后超滤管内获得的液体的吸光度记为A2，通过标曲将其分别换算为浓度B1与B2。

附录

附件清单

附件1：脂质溶液浓度与粒径/PDI的关系图

附件2：Liposome合成总流速与粒径/PDI的关系图

附件3：Liposome合成流速比与粒径/PDI的关系图

附件4：乙醇浓度与稀释溶液对Liposome粒径/PDI的影响

附件5：DOX-A480标准曲线

附件1：

脂质体（Liposome）合成中，脂质浓度与粒径/PDI的关系图

实验条件：仪器：FluidicLab NP-S2；芯片：FluidicLab-COC-LNP-B1

总流速：16 mL/min；流速比（脂相：水相=1：4）；前废液：0.3 mL；

Liposome空包无DOX；

产物经硫酸铵缓冲液稀释至乙醇浓度为2.5%后进行DLS检测。

可见该配方下，15 mM脂质溶液合成的脂质体粒径最小，且均一度佳。

附件2

脂质体（Liposome）合成中，合成总流速与粒径/PDI的关系图

实验条件：仪器：FluidicLab NP-S2；芯片：FluidicLab-B1

40 mM脂质溶液；流速比：1：3（脂相：水相）；前废液：0.3 mL；

Liposome空包无DOX；产物经硫酸铵稀释至乙醇浓度为2.5%。

可见该配方下，16 mL/min的总流速合成的脂质体粒径更小，均一度佳。

附件3

脂质体（Liposome）合成中，合成流速比与粒径/PDI的关系图

实验条件：仪器：FluidicLab NP-S2；芯片：FluidicLab-B1

40 mM脂质溶液；总流速16 mL/min；前废液：0.3 mL；

Liposome空包无DOX；各产物经硫酸铵稀释，确保乙醇浓度统一为2.5%。

可见该配方下，1：4的流速比合成的脂质体粒径最小。

附件4

乙醇浓度与稀释溶液对脂质体（Liposome）粒径/PDI的影响

实验条件：仪器：FluidicLab NP-S2；芯片：FluidicLab-B1

20 mM脂质溶液；总流速16 mL/min；流速比1：4（脂相：水相）；前废液：0.3 mL；Liposome空包无DOX；产物经不同溶液与稀释倍数稀释。

可见虽然水稀释测得的粒径更小，但PDI却较高，且在1000 nm以上的位置产生了小峰（见下图）。这有可能是离子浓度发生了较剧烈改变导致的。因此为了获得更稳定的结果，我们推荐使用300 mM硫酸铵缓冲液将乙醇稀释至2.5%及以下。

附件5

DOX-A480标准曲线