QuantSeq 表达谱文库构建试剂盒|96/24|015.96-北京启衡星生物科技有限公司

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QuantSeq 文库构建试剂盒通过oligo dT引物特异逆转录含poly (A)尾的mRNA，第二链使用随机引物进行合成。由于插入片段的大小是由第二链合成引物和poly(A)尾之间的距离决定的，因此无需额外进行 RNA 片段化。随后的PCR可以提供9,216个不同的i5/i7index组合用于Illumina平台，48个index 用于Ion Torrent平台。能够实现更多样本混样测序。

3’ 端链特异性比对

以FDA提供的测序质控 (SEQC) 标准样品A和B为样本（A和B分别是ERCC外源RNA与有参RNA的混合物1和混合物2）1,2，用QuantSeq试剂盒进行文库构建，测序数据与近期生物分子资源实验室协会 (ABRF) 发布的NGS研究中的mRNA-Seq数据组比对3。在常规mRNASeq中，测序Reads覆盖转录本的全长，而QuantSeq的Reads仅覆盖转录本的3’端。QuantSeq在精确检测基因表达水平的同时，节省了大于90%的测序深度。

由于spike-in转录本(RNA质控品)仅来源于正义链的转录，因此链特异性的评估可以不依赖于于任何基因组注释。在各种情况下QuantSeq数据均显示出高于99.9%的链特异性，而两个被评估的mRNA-Seq SEQC数据集(data sets)链特异性仅分别为93.4%和97.8%。QuantSeq可降低噪音，能够实现准确检测及定量反义转录本。

基因差异表达分析通过使用“erccdash- board” 软件 4，对QuantSeq和常规mRNA-Seq的基因差异表达的检测能力进行了对比。当测序的Reads数由10M降低到0.625M，QuantSeq维持了相当高的曲线面积值（AUC 0.860-0.897），而常规mRNA-Seq的曲线面积值较低，在0.736到0.776之间.

Quantseq在高质量和低质量（FFPE）样本中有很好的相关性

Quantseq有非常高的灵敏度。测序量在26.5M reads时， RNA完整性好的新鲜冷冻样本中检测到25,842个基因(数据未显示)。当单个样本测序数据量在2.5M时，在新鲜冷冻样本中检测出20,081个基因，且每个基因至少有1个read；相应的，在FFPE样本中能检测到15,190个，两者有24%的差异。但是，当阈值提高到5或者10个reads/基因时，差异分别下降至3%和1%。这些比对结果表明，QuantSeq能够可靠地对冷冻保存和FFPE样品进行基因表达分析。两者之间在低

表达基因检测存在的差异，是由于FFPE样本在处理、储存及回收过程中低拷贝转录本很容易降解至无法检测到。

Quantseq用oligo(dT)引物进行逆转录，每个转录本只产生1个片段。这样能够使得无论RNA的质量如何(包含FFPE样本)都可准确定量。常规的mRNA-seq操作流程旨在覆盖整个转录本，但是在使用降解样本时将导致严重的3’偏好性。因此，相对于其他用Poly(A)分选mRNA操作流程，Quantseq 3’mRNA-Seq更有效的对低质量的样本进行建库。

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