生物电镜冷冻制样：做了才知道有多难

　　仪器信息网讯 2015年5月29日-6月2日，“2015全国生物医学农林电镜技术研讨会暨生物电镜前沿技术培训班”在浙江大学举行。本次会议特别邀请了国内外知名专家教授和电镜工作者讲授生物电子显微镜技术的最新发展，交流生物样品制备和应用方面的技术经验，并安排部分学员参加实验操作及演示。

　　台湾中央研究院植物暨微生物学研究所简万能博士作了题为“Ultrastructure of plant cells using high pressure freezing and freeze substitution”的报告。

简万能博士

　　据介绍，由于早年看到所有的教科书都说想要获得更好的电镜观察结果，就要用冷冻制样技术，简万能便开始了这方面的研究，然而不做不知道，一做才知道有多难。冷冻制样对于动物来说比较简单，而对于植物来说由于细胞壁的影响却非常难。20年来，在研究当中，他碰到的失败的次数永远比成功多。“但是当你成功后，你会发现你的眼界比以前做化学固定大得多。”简万能这样说道。

　　“电镜是生物学研究非常有用的工具。由于生物细胞的含水量可以达到80%-90%，所以制样能否成功主要是解决水的问题。传统的透射电镜制样技术，对样品损伤最大的步骤是脱水，往往使得细胞结构发生很大的变化。而利用冷冻制样最大的优点就是可以保持细胞原来的结构，并保持一些可溶性的物质。如果要做溶在细胞质里的元素分析，一定要采用冷冻制样技术。”

　　由于水在冷冻的过程中会形成冰晶影响观察，所以在如何避免形成冰晶是冷冻制样的一个关键点。简万能表示：“在制样中一定要注意一些关键的温度节点。如-137℃是水的重结晶点，如果能迅速降低到这一温度，样品中的水就会形成玻璃态的冰。如果超过-70℃，玻璃态的冰就会形成二次冰晶。”

　　在报告中，简万能介绍了目前常用的冷冻方法，如投入式冷冻、冷金属块撞击式冷冻、丙烷喷射冷冻、高压冷冻等。并指出高压冷冻的优点是可以做活的生物样品，可以做超过200μm厚的样品。

　　此外，简万能还介绍了在冷冻固定之后，如何更好的实现冷冻置换。他表示，如果要做超薄切片，高压冷冻和冷冻置换是最好的选择，可以获得非常好的样品形态，会有更多的信息被保留。

　　在研讨会之后，简万能博士亲自指导参加培训的学员，进行了投入冷冻、高压冷冻、冷冻置换等实验操作。

撰稿：秦丽娟

    第一届电镜网络会议：http://www.instrument.com.cn/webinar/icem2015/