导读:目前,非变性质谱技术主要应用在两个方面:一是生物制药领域,通过打开单克隆抗体链间二硫键后在Cys位点上偶联小分子药物(Cys-ADC)的完整分子量分析,此类药物的链间仅靠非共价力结合,故变性条件下各条链会分离,无法测得其完整状态的分子量;另一应用方向为研究蛋白质多聚体,非变性条件下不仅可以保持各个亚基间的非共价相互作用。
何为非变性质谱?就是选用温和的溶液体系及质谱条件,使蛋白保持在非变性状态下被分析。听到这,有些小伙伴可能会一头雾水:师兄师姐教我处理蛋白质样品的时候,第一步就是要变性啊,怎么现在又不要变性了?
在通常的蛋白质相关分析中,为了破坏蛋白质的三维立体空间结构,便于酶解等操作,会通过加热或是加入高浓度的变性试剂(如尿素、盐酸胍等),使蛋白质变性;另外,对于常用的分离手段——反相色谱来讲,其流动相的酸性pH条件与高有机相同样也会使蛋白质变性。当需要对蛋白质中的非共价结合进行研究时,为了避免非共价结合被强烈的变性条件所破坏,则需在非变性的液相-色谱条件下(通常为50mM醋酸铵,pH=7的中性体系)进行研究;另外,对于组成较为复杂的蛋白样品,在非变性条件下分析时,由于体系中质子数减少,所以蛋白电荷态数目也会相应减少,电荷态之间的相互重叠度也会下降,进而减少复杂组分之间的相互影响,从而能够得到复杂蛋白样品中每个组分的分子量信息(图1)。
图1 同一样品分别于变性及非变性条件下进行分子量测定的原始谱图
目前,非变性质谱技术主要应用在两个方面:一是生物制药领域,通过打开单克隆抗体链间二硫键后在Cys位点上偶联小分子药物(Cys-ADC)的完整分子量分析,此类药物的链间仅靠非共价力结合,故变性条件下各条链会分离,无法测得其完整状态的分子量;另一应用方向为研究蛋白质多聚体,非变性条件下不仅可以保持各个亚基间的非共价相互作用,同时由于中性条件更接近生理状态,得到的结果更具意义。
现在,非变性质谱与氢氘交换、X-ray衍射、核磁共振、冷冻电镜和cross-linking等技术联合使用、互为补充,已经越来越多的被应用在结构生物学、生物医药等领域的研究中。本期文章将会重点介绍非变性质谱在治疗性生物医药制品完整分子量测定中的研究,下期文章将会侧重介绍非变性质谱用于蛋白复合物的研究进展。
Orbitrap超高分辨质谱:非变性质谱研究的理想平台
古人云:工欲善其事,必先利其器。要想研究做得好,趁手工具不可少!针对于非变性质谱研究中的需求,我们在Orbitrap质谱平台上对相关参数进行了优化,包括离子源区脱溶剂能量、质量范围的扩展以及高质荷比离子传输效率的优化等,使Orbitrap在固有的高分辨率、高质量精度及高灵敏度基础上,在非变性质谱领域也能有出色表现。
图2 Orbitrap质谱平台用于非变性质谱分析
上文中提到,在生物制药领域中,会通过分子工程设计,在单克隆抗体的特定氨基酸上通过化学反应,偶联上小分子治疗药物,通过单克隆抗体的靶向识别功能将小分子药物精确带至病变细胞处并释放,达到精确给药、减少毒副作用的目的,这类药物被称作抗体药物偶联物(Antibody Drug Conjugates,ADCs)。在这类药物中,通过将单抗链间二硫键打开从而在Cys位点上偶联药物的Cys-ADC,由于其链间仅靠非共价力结合,故需在非变性质谱条件下才能对其完整分子量进行测定(图3)。
图3 Cys-ADC结构示意图
图4展示了使用非变性质谱平台对Cys-ADC进行完整分子量测量的结果。由图中不难发现,使用体积排阻色谱(SEC),可以将单克隆抗体与其他杂质分离开,而Orbitrap质谱平台能够得到基线分离、信噪比高的原始谱图。经数据处理软件解卷积处理后,可见偶联了0/2/4/6/8个小分子药物的簇峰分布,符合Cys-ADC的典型分布特征;解卷积后计算所得该ADC的药物/抗体比值(Drug to Antibody Ratio, DAR),与之前报道过的DAR值相符。
图4 使用非变性质谱平台对Cys-ADC进行完整分子量测量。
(上),原始色谱/质谱图;(下),解卷积后谱图。
作为对照,在变性条件下也对同一个样品进行了分子量测定(图5),发现链间的非共价结合在强烈的变性条件下均被破坏,只能观察到部分ADC的分子量信息。该实验进一步说明了在非变性条件下对Cys-ADC进行分子量测定的必要性。
图5 变性质谱条件下对Cys-ADC进行分子量测量。
(上),原始色谱/质谱图;(下),解卷积后谱图。
对于常见的另外一种ADC——Lys-linked ADC,虽然其小分子药物与单克隆抗体是通过共价键相结合,但偶联上小分子药物后,ADC的复杂度大大增加,此时若在非变性条件下进行分子量测定,可以减少信号之间的干扰,得到更加准确的测量结果(图6)。
▲非变性条件可减少复杂组分间信号重叠
▲非变性条件下Lys-ADC完整分子量测量结果
图6 使用非变性质谱平台对Lys-ADC进行完整分子量测量。
小结
本期我们对非变性质谱技术的原理、适用范围进行了介绍,并以Cys-ADC与Lys-ADC样品的完整分子量测量为例展示了该方法的应用,不知道小伙伴们有没有对非变性质谱技术有个初步的了解呢?下期我们将会介绍该技术在蛋白复合物研究中的应用,各位看官走过路过不要错过,我们下期见!
参考文献
[1] Dabaene et al., Anal Chem. 2014, Nov 4;86 (21):10674-83.
来源于:赛默飞世尔科技
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