通过高分辨成像质谱分析大鼠视网膜中氯喹的分布

在药物研发过程中，候选化合物的体内药代动力学分析是非常关键的步骤。该分析不仅可以掌握其药效药理，还可以得到和毒性评价有关的信息。通常，使用放射性自显影技术(Autoradiography: ARG)和荧光色素标记细胞的方法进行分析。但是，使用ARG的方法成本高，而且一方面这些方法无法区别原药和代谢物，另一方面标记物质的行为可能与未标记物存在差异。因此，最近成像质谱分析法，不进行标记即可对候选化合物进行检测的方法备受瞩目。质谱成像法除了能够在无标记的情况下对各种物质的分布进行分析，还能够使用同一切片同时分析原药及其代谢物，有望在今后的药物研发领域得到应用，取得新的突破。本文介绍使用成像质谱显微镜iMScope TRIO对氯喹给药后大鼠视网膜进行检测的示例。

图1 氯喹的结构式

大鼠视网膜中氯喹的高空间分辨率成像

在本次分析中，对给予抗疟剂药物氯喹的大鼠视网膜进行分析。图1为氯喹的结构式。使用氯喹标准品进行分析，对基质及测定模式进行优化，表1为组织切片的分析条件。使用成像质谱显微镜iMScope TRIO进行高空间分辨率成像，发现在约10 μm厚的视网膜色素上皮周围有氯喹的分布(图2和图3)。在测定氯喹时，如果使用成像质谱分析法常用的MS模式，因受到生物体衍生杂质带来的离子抑制、干扰的影响，无法得到清晰的MS图像(此处数据省略)。在本次分析中，通过iMScope TRIO的MS/MS模式进行测定，提高灵敏度，能够获得10 μm的高空间分辨率下的MS/MS图像。

图2 组织切片上的MS/MS质谱图

图3 光学图像和MS/MS质谱图像

大鼠眼球中氯喹的高速成像

在药代动力学研究过程中，为了阐明药物分子在细胞及器官水平的特征分布区域，分别需要在高空间分辨率及中等空间分辨率获得药物分子的分布信息。本实验使用MS/MS模式测定在中等分辨率(50 μm)下测定大鼠眼球整体的氯喹分布情况，分析条件如表2 所示。虽然使用了更大的激光直径，有可能带来存在噪音高、离子抑制等问题，iMScope TRIO 依然能够检测得到具有较高信噪比的氯喹特征碎片，并获得清晰的质谱图像。成像质谱实验的采集

速度取决于目标检测区域中所包含的点数。iMScope TRIO能够独立更改激光直径及采集间隔等参数，从而能够轻松控制采集速度及图像尺寸，并且不会影响数据质量。

基质涂敷方式的比较

在氯喹成像质谱分析中，比较了2 种不同的MALDI 基质涂敷方式。 图5 显示了由升华法获得的成像结果(基质升华方式的示意图如图6 所示)。基质升华由iMLayer 升华仪自动完成，而喷雾方式由手动完成。喷雾方式获得成像结果如图7 所示。对比两种方式的检测结果，升华法获得了更加清晰尖锐的氯喹分布图像，而喷雾的结果则看起来会有一些扩散，如图7 所示。前处理方式的优化依然取决于组织切片的特性以及所使用的基质类型。如示例中的结果，前处理步骤对最终成像结果的图像质量有显著的影响，不仅仅是切片制备的条件，基质涂敷的过程也很重要。

图6 基质升华方式示意图

在相同切片上进行MS 和MS/MS 成像分析

成像质谱分析中，在同样位置只能采集一次数据。但是，使用iMScope TRIO 可以调整激光直径及采集间隔，因此可以在采集点之间留下未采集区域，从而实现更多次的成像分析。图8显示了使用激光直径为5μm，采集间隔为10μm时，在同一采集区域内进行4次成像分析的方式。

图4 组织切片上氯喹的MS/MS产物离子质谱图，激光直径50μm

图5 升华法获得的氯喹分布质谱图像

图7 喷雾法获得的氯喹分布质谱图像

图8 在同一测定区域进行1次MS分析及3次MS/MS分析的数据采集设置方式示例