【分享】利用多对引物/探针分析比较qRT-PCR和ddPCR两种方法对SARS- COV-2检测

利用多对引物/探针分析比较qRT-PCR和ddPCR两种方法对SARS-COV-2检测

Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets

发表期刊：Emerging Microbes & Infections 2020

影响因子：6.9

作者单位：a State Key Laboratory of Virology, Modern Virology Research Center, College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan, People’s Republic of China;

b State Key Laboratory of Virology, Renmin Hospital, Wuhan University, Wuhan, People’s Republic of China;

c Department of Infectious Disease, Zhongnan Hospital, Wuhan University, Wuhan, People’s Republic of China;

d Frontier Science Center for Immunologyand Metabolism, Wuhan University, Wuhan, People’s Republic of China

研究目的

通过使用不同的引物探针对比较qRT-PCR和ddPCR两种检测方法对SARS-COV-2的检测情况。

研究背景

SARS-CoV-2的大流行对临床病原体诊断提出了迫切的要求。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）测定法是检验的金标准，已被广泛用于快速检测SARS-CoV-2感染。但是，qRT-PCR结果不准确的问题日益暴露，qRT-PCR的假阴性报告（FNR）不可避免的，这可能会影响及时诊断，早期治疗，预防传播和评估出院标准。液滴数字PCR（ddPCR）用于SARS-CoV-2核酸检测的补充使用可以最大程度地减少FNR。

研究人群和样本采集

本研究中，我们使用健康人和SARS-CoV-2感染患者的鼻咽拭子cDNA，在相同条件严格比较了8种常用的引物/探针组的qRT-PCR和ddPCR的性能。

实验结果

图1A为RT-PCR检测结果，在健康人样本为阴性对照，其中引物对UCDC-N1、UCDC-N2、CCDC-N  CT值<40表明有非特异性扩增这样易导致10−4和10−3稀释的低病毒载量的样本检测结果易出现假阳性， 相反，在没有非特异扩增的引物探针对中， UCDC-N3，HKU-，Charité-E和HKU-ORF的检测低载量的病毒样本时，易出现假阴性。并且根据结果来看最灵敏的引物探针对CCDC-ORF在10−4稀释时可以检测到3/10（30％）阳性样品。另外，引物探针对CCDC-ORF在病毒载量低时CT值范围从35.5到39.4，一致性较差，在病毒载量较高时结果一致性较好表明qRT-PCR仍然是检测正常病毒的可靠方法。

图B表示使用相同引物/探针组的ddPCR结果，表明ddPCR在低病毒载量样本的检测总体上有所改善。健康样本对照中，尽管显示UCDC-N1和N2有扩增背景但它们仍然可以区分低病毒载量样品（稀释10−4）。此外，虽然UCDC-N3，HKU-N和CCDC-N显示较低的非特异性扩增背景，Charité-E，HKU-ORF和CCDC-ORF没有任何非特异性扩增，但是，所有低病毒载量的样本都可以产生正确的阳性报告。因此，ddPCR可以在病毒载量较低时，可以显着减少检测中的FNR和FPR。

图1. 不同引物/探针组的qRT-PCR和ddPCR结果

（A）   使用不同引物/探针组进行qRT-PCR的结果。横坐标为稀释倍数（转换为log10），纵坐标为Ct值， ND为阴性CT值≥40。

（B）   使用不同引物/探针组的ddPCR结果。横坐标为稀释倍数（转换为log10）纵坐标为拷贝数。ND为阴性0拷贝。对于每个引物探针组，绿色阴影区域为健康人的样本（IgM / IgG阴性），超出该阈值为阳性。

结果讨论

结果表明，与qRT-PCR相比，ddPCR方法可显着减少不准确的结果，包括FNR和FPR。同时，由于qRT-PCR这种标准检测方法易出现FNR或FPR，对于SARS-COV-2临床检测的更好选择是核酸测试。

结合成像，血清测试以及经验丰富的临床医生的判断，而不是仅仅依靠qRTPCR。总之，qRT-PCR适用于大规模诊断正常病毒载量样本中病毒感染的检测。但是，对灵敏度和精度有特殊要求的定量ddPCR将是更理想的方法。

关于我们

广州永诺生物科技有限公司成立于2010年，总部位于广州国际生物岛，是一家专注于医学科学技术开发与服务、分子诊断产品研发与生产的高新技术企业。公司目前占地面积近6000㎡，其中硕、博士以上学历员工占比近40%。公司依托先进的技术力量以及优秀的人才储备，在科研服务、医学检测和数字PCR产品三大业务上保持领先的竞争优势。

公司成立至今申请国家专利40多项，授权21项，计算机软件著作权8项，广东省高新技术产品证书8项，省、市等科技计划项目10多项，2018年入围了大湾区生物科技创新企业50强，获得国家高新技术企业，广州市科技创新小巨人企业、广东省高新技术企业培育库入库企业、广州市企业研发机构等荣誉称号。

永诺医疗是永诺生物的全资子公司，以“中国智造”为己任，专注于数字PCR仪器与应用试剂的研发，并于2017年成功研发了国内首款拥有完全自主知识产权的MicroDrop®系列微滴式数字PCR系统并投入生产。