中国科学家发现新冠病毒mRNA合成、基因组复制矫正等分子机制

新冠病毒肺炎疫情至今已造成全球1.4亿人感染和300余万人死亡。随着疫情进展，突变病毒株不断出现，对中和抗体和疫苗的防护效果提出了严重挑战，迫切需要针对各型突变株中高度保守的转录复制过程开展深入研究，阐明关键药物靶点的工作机制，发现能够有效应对各种突变株的抗病毒药物。 

新冠病毒是目前已知RNA病毒中基因组最大的一种病毒（约30 kb），其基因组编码了一系列非结构蛋白，并按照一定的空间和时间顺序，形成复杂的超分子蛋白质机器“转录复制复合体”（RTC），负责病毒转录复制的核心过程，包含了众多保守的抗病毒药物设计的关键靶点。由于基因组极大，同时聚合酶复制保守性较差，新冠病毒进化出一种独特的“复制矫正”（proofreading）机制，利用转录复制复合体中关键的nsp14蛋白对复制过程进行矫正，一旦发现聚合酶合成了错误配对的碱基，立刻通过nsp14具有的外切核酸酶（ExoN）将错误碱基处理掉，保证复制的准确进行，这也是病毒逃逸核苷类抗病毒药物的关键途径。同时，nsp14是一个独特的双功能蛋白，除负责复制矫正的外切核酸酶外，还拥有一个N7甲基化酶（N7-MTase），负责mRNA加帽过程关键的第三步催化反应。复制矫正和加帽过程如何进行，特别是两个截然不同的生化过程如何在一个nsp14蛋白中协同作用，是20多年来冠状病毒研究领域中最关键的几个“未解之谜”之一。 

2021年5月24日，清华大学饶子和院士、娄智勇教授团队与上科大高岩博士合作在Cell发表研究论文Cryo-EM Structure of an Extended SARS-CoV-2 Replication and Transcription Complex Reveals an Intermediate State in Cap Synthesis，解析了新冠病毒超分子蛋白质机器“转录复制复合体”关键状态的三维结构，揭示了病毒mRNA加帽、基因组复制矫正、逃逸核苷类抗病毒药物的分子机制。这是该团队在新冠病毒转录复制复合体研究中，继在Science、Cell等期刊上连续发表4项成果后的又一重要工作。 

新冠疫情爆发后，清华大学饶子和院士、娄智勇教授团队针对新冠病毒转录复制机制开展的深入研究，先后阐明了“核心转录复制复合体”（C-RTC）^[1]、“延伸转录复制复合体”（E-RTC）^[2]和“加帽中间态转录复制复合体”[Cap(-1)’-RTC]^[3]的工作机制。在此基础上，研究团队成功解析了Cap(-1)’-RTC与nsp10/nsp14形成的超级复合体Cap(0)-RTC的三维结构（图1）。 

图1 新冠病毒Cap(0)-RTC的工作机制 

在该复合体中，nsp9蛋白发挥了“适配器”（adaptor）的作用，通过与nsp14蛋白相互作用，将nsp10/nsp14复合体招募到Cap(-1)’-RTC中，从而利用nsp14的N7甲基化酶结构域完成mRNA加帽过程的第三步关键反应。尤为重要的是，研究团队发现Cap(0)-RTC在溶液状态下会形成稳定的同源二聚体。在二聚体中，解旋酶nsp13通过其1B结构域的重大构象变化，引导模板核酸链反向移动，引发产物链backtracking机制，从而将产物链3’末端传输至另一Cap(0)-RTC的nsp14外切核酸酶结构域的反应中心，完成错配碱基的矫正过程（图2）。 

图2新冠病毒复制矫正的in trans backtracking机制 

这一发现所提出的in trans backtracking的复制矫正机制，与真核/原核细胞RNA聚合酶Pol II的复制矫正机制具有一定的类似性，表明作为基因组最复杂的RNA病毒，新冠病毒的转录复制过程已与高等生物具有一定的类似性，阐明了冠状病毒研究领域20多年来悬而未决的关键科学问题。同时，复制矫正机制是新冠病毒逃逸核苷类抗病毒药物（如瑞德西韦）的关键机制，一旦核苷类药物被加入RNA产物链中，即会被病毒的复制矫正过程去除，从而丧失抑制活性，目前仅有NHC及其衍生物可以逃逸该过程。该成果也将对未来进一步优化和发展新型核苷类抗病毒药物提供关键的结构基础。 

该成果的获得得益于研究团队在冠状病毒转录复制领域中17年多的长期积累。自新冠疫情发生后，研究团队系统研究了新冠病毒转录复制过程，阐明了关键药物靶点蛋白主蛋白酶Mpro和转录复制复合体多个状态三维结构，为认识病毒的生命过程、发展高效抗病毒药物提供了关键信息，先后在Nature^[4]、Science^[1]、Cell上^[3,5]和Nature Communications^[2]上发表系列研究论文，是国际上抗新冠药物靶点研究中最为系统、引用最多的工作之一。 

清华大学饶子和院士、娄智勇教授/ChangJiang学者特聘教授和上海科技大学的高岩博士为共同通讯作者，清华大学医学院和生命学院的闫利明博士、杨云翔博士，以及博士生李明宇、张盈、郑礼涛、葛基、黄雨岑、刘震宇为共同第一作者。 

专家点评（一） 

钟南山（中国工程院院士） 

从“非典”到“新冠”，科学依靠坚守 

基础研究是科技创新的源头，是人类认识自然、适应和改造自然的知识源泉，需要科学家长期的坚守和耕耘。 

自2003年“非典”开始，在不到20年的时间里，全球已经出现了3次由冠状病毒导致的传染病。尤其是此次新冠疫情，在全球已经造成超过1亿多人感染，而且随着疫情发展，突变病毒不断出现，一些已有的中和抗体不能很好的中和突变病毒，部分疫苗针对突变病毒的保护效果也有一定程度下降。深入认识病毒的生命周期，开发能够有效应对各种突变病毒的广谱抗病毒药物，将成为今后一段时间抗疫工作的重点内容之一。 

目前针对新冠病毒的抗病毒药物研究，主要针对的是病毒转录复制过程的关键靶点蛋白，如蛋白酶和聚合酶等。针对这两个靶点的抑制剂已有相当数量的进入临床实验，例如瑞德西韦（Remdesivir）等。以瑞德西韦为代表的核苷类抗病毒药物主要作用于病毒的聚合酶，在被掺入产物核酸链后，阻断病毒核酸的合成，进而抑制病毒的转录复制过程。然而，在此类抑制剂进入临床研究后，其抗病毒效果与预期有一定差距。除药物代谢等问题外，冠状病毒通过特有的“复制矫正”（proofreading）机制逃逸核苷类抗病毒药物的抑制，可能是此类抗病毒药物抑制效果不佳的一个重要原因，目前仅有NHC及其衍生物能够躲避病毒复制矫正机制的干扰。对这个机制开展深入研究，将为今后发展广谱、高效的抗冠状病毒药物提供关键的科学信息。 

子和教授及其团队在新冠疫情爆发后，针对新冠病毒转录复制机制开展了系统研究，先后阐明了“核心转录复制复合体”（C-RTC）^[1]、“延伸转录复制复合体”（E-RTC）^[2]和“加帽中间态转录复制复合体”[Cap(-1)’-RTC]^[3]的工作机制。在这些工作的基础上，他们又在世界上第一次成功组装成含有形式复制矫正功能的nsp14蛋白的超分子机器Cap(0)-RTC。通过结构分析，他们发现在Cap(0)-RTC形成的同源二聚体中，解旋酶通过自身构象改变，引导模板核酸链反向移动，引发产物链“回溯”（backtracking）机制，进而将产物链3’末端传输至另一Cap(0)-RTC的nsp14外切核酸酶结构域的反应中心。复制矫正机制是新冠病毒逃逸核苷类抗病毒药物的关键机制，一旦核苷类药物被加入RNA产物链中，在其被聚合酶感知为“错配碱基”后，立刻会被病毒的复制矫正过程去除，从而丧失抑制活性。他们的研究工作，为我们生动展现了这一过程的可能机制。复制矫正的回溯机制，是从低等到高等生物细胞保证基因复制准确性的重要机制，但在病毒中以往还没有发现此类机制。这一研究成果不但发现病毒中的类似机制，是认识生命进化的重要成果，而且为进一步优化和发展新型核苷类抗病毒药物提供了关键的结构基础。 

子和教授自2003年SARS爆发后，就一直在冠状病毒转录复制机制研究领域开展工作，至今已坚持了18年。2003年SARS疫情爆发期间，我当时即已了解子和教授在SARS病毒的一系列成果，智勇教授那时才刚刚开始博士阶段的学习。子和教授的研究组在国际上率先解析了SARS-CoV主蛋白酶的三维结构^[6]，并研发了一系列高效抑制剂^[7]，他们当时在转录复制复合体上的研究^[8]至今仍被国际同行认为是冠状病毒转录复制复合体机制研究的“开篇之作”。这些积累，为新冠疫情爆发后他们在新冠病毒基础研究中取得的一系列重要成果奠定了坚实的基础，通过阐明新冠病毒主蛋白酶和转录复制复合体多个状态的三维结构，为认识该病毒的生命过程、发展高效抗病毒药物提供了关键信息，先后在Nature^[4]、Science^[1]、Cell^[3,5]和Nature Communications^[2]上发表系列研究论文，是国际上抗新冠药物靶点研究中最为系统、引用最多的工作之一。 

2020年9月11日，习近平总书记在科学家座谈会上总结了新时代科学家精神，强调要有勇攀高峰、敢为人先的创新精神，追求真理、严谨治学的求实精神，淡泊名利、潜心研究的奉献精神，集智攻关、团结协作的协同精神，甘为人梯、奖掖后学的育人精神。18年来，子和教授的团队中有100多人先后参与冠状病毒研究，累计发表50余篇研究论文，引用超过6000余次，均篇引用超过100次，一批早期参与的俊彦陆续成长为国家科研骨干。科学依靠坚守，子和教授团队在冠状病毒的奋斗历程，对科学家精神做了一个很好的诠释。 

专家点评（二） 

康乐（中国科学院院士） 

从结构生物学角度认识新冠病毒的转录复制机制 

新冠病毒造成的疫情，是近一个世纪以来人类面对的最大的一次公共卫生事件，深入研究病毒生命周期的分子机制，是认识病毒特征、研发抗病毒手段的关键所在。新冠病毒非常特殊，它的基因组是目前已知RNA病毒中基因组最大的一种，其生命过程所涉及的分子机制也非常复杂。新冠病毒通过两个机制保证蛋白质翻译和相对准确的转录复制过程，一是要在病毒mRNA前端加上一个帽结构（cap），用于维持mRNA的稳定性和蛋白翻译的有效进行；二是通过一个独特的“复制矫正”（proofreading）机制，对病毒基因组的复制实施控制，一旦发现核酸中的错配碱基，随时进行修正。病毒转录复制复合体上的nsp14蛋白参与了这两个关键过程，可通过其C端的N7甲基化酶完成mRNA加帽过程的第三步催化反应，同时还可通过其N端的外切核酸酶完成复制矫正过程。这一现象在“非典”病毒（SARS-CoV）即已发现，但20年来一直无法回答两个截然不同的过程如何由一个蛋白来协同执行，是冠状病毒研究领域中多年来关注的核心基础生物学问题之一。 

清华大学饶子和教授、娄智勇教授团队与上海科技大学合作在Cell发表的这一工作，解析了两种不同状态的“Cap(0)转录复制复合体”Cap(0)-RTC的三维结构，发现在转录复制复合体中，病毒编码的nsp9蛋白发挥了“适配器”（adaptor）的作用，将nsp10/nsp14形成的复合体招募到聚合酶上，与聚合酶上的NiRAN结构域共同形成一个“共转录加帽复合体”（Co-transcriptional Capping Complex, CCC），展示了mRNA加帽过程中，mRNA 5’端在多个关键酶分子之间的传输路径，第一次明确揭示了基因组超大的RNA病毒是如何将以聚合酶为中心的“延伸复合体”（Elongation Complex,  EC）与“加帽复合体”连接起来。更加重要的是，他们在研究中发现Cap(0)转录复制复合体在溶液状态下会形成稳定的同源二聚体，通过深入研究该二聚体的结构，提出了冠状病毒复制矫正中称之为反式回溯（in trans backtracking）的机制。进一步的研究发现，在二聚体中，一个Cap(0)转录复制复合体的聚合酶催化中心与另一个Cap(0)转录复制复合体的nsp14外切核酸酶结构域催化中心相对，使合成的产物RNA 3’末端能够通过回溯的方式传输到nsp14外切核酸酶结构域进行加工。同时，他们还发现解旋酶nsp13的1B结构域发生了重大构象变化，并通过与模板核酸链的作用，引导模板核酸链反向移动，引发产物链回溯机制。值得指出的是，通过回溯的方式进行复制矫正，在真核/原核细胞中广泛存在，但是在病毒中还是第一次观察到此类机制。虽然该过程与真核/原核细胞Pol II转录过程的复制矫正机制具有一定类似性，但在Pol II的研究中，并未观测到蛋白具有巨大的构象变化，因而Pol II中回溯的驱动力也不是十分明确，而该工作表明解旋酶通过构象变化提供了回溯的驱动力，为深入理解这一基础生物学过程提供了重要的范例。