背景介绍
缬沙坦是血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)、联苯四氮唑结构的沙坦类化合物,用于各类轻中度高血压的治疗,尤其适用于ACE抑制剂不耐受的患者。2018年7月,药品监管部门首次在含有缬沙坦的产品中发现亚硝胺杂质——N二甲基亚硝胺(NDMA)。随后在沙坦类其他药物和雷尼替丁中都检测到各类亚硝胺杂质,例如N-二乙基亚硝胺(NDEA)、N-二异丙基亚硝胺(NDIPA)、N-乙基异丙基亚硝胺(NEIPA)和N-亚硝基二丁胺 (NDBA)。因此,对使用缬沙坦原料药的药品进行了全球召回,导致缬沙坦药品暂时短缺。
图1 N-亚硝胺的分子结构
根据世界卫生组织 (WHO) 的国际癌症研究机构 (IARC)的研究,大多数亚硝胺会对动物和人类具有致癌和遗传毒性。沙坦类药物大多含有四唑环,四唑环的形成需要亚硝酸钠;药物的生产设备、生产用试剂和溶剂(例如普通溶剂DMF中的二甲胺)也可能会带来污染,都有可能形成亚硝胺。欧洲药典 (Ph. Eur.) 委员会将 API 中亚硝胺的临时限值设定为低于 1 ppm,且于2020年底降至30 ppb。
低限值设定就需要使用灵敏度高和选择性好的分析方法。本应用参照美国FDA指南的方法进行优化,通过GC/MS/MS在EI源 MRM模式下痕量检测缬沙坦药品中的5种亚硝胺杂质 (NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA 和 NDBA),并根据USP要求进行方法学验证。
实验条件
GC-MS/MS 方法检测不同的亚硝胺化合物,使用液体直接进样方式。与FDA方法相比,选择了膜厚更薄(0.5µm而不是1µm)的Supelcowax®柱,符合USP通则中<621>色谱法的规定。色谱条件以及质谱条件见表1-3。
表1 色谱条件
色谱柱 | SUPELCOWAX® 10, 30 m x 0.25 mm I.D., 0.5µm (24284) |
检测器 | MS/MS |
进样口温度 | 250℃ |
柱温箱程序 | 40℃保持0.5min,20℃/min至200℃, 60℃/min 至250℃保持3min |
载气及流速 | 氦气,1.0mL/min |
衬管 | 4 mm单径锥衬管带玻璃棉 |
进样量 | 2 µL |
进样模式 | 脉冲不分流 |
样品稀释剂 | 二氯甲烷 |
样品制备 | 使用切片工具,取药片的四分之一放入15mL离心管,加入5mL二氯甲烷。将样品涡旋1分钟,并置于离心机中以4000 rpm离心2.5min。取二氯甲烷层上清液2mL,用0.45µm PVDF膜过滤。取续滤液0.5mL到2mL样品小瓶中并加盖。 |
标准溶液 | 二氯甲烷作为溶剂,配制得到浓度分别2.5、5.0、10、20、40、80、100ng/mL的5种亚硝胺(NDMA/NDEA/NEIPA/NDIPA/NDBA)校准溶液。 |
表2 质谱条件
调谐 | 自动调谐 |
离子源及采集模式 | EI源,MRM |
碰撞气体 | 氮气 @ 1.5mL/min |
淬灭气体 | 氦气 @ 4.0mL/min |
溶剂延迟 | 7 min |
离子源温度 | 230°C |
四极杆温度 | 150°C |
电离电压 | 70 eV |
驻留时间 | 50 ms |
表3 MRM 离子对参数列表
峰 | 化合物 | Transition | 保留时间 |
1 | N二甲基亚硝胺MRM2 | 74→42 | 6.952 |
N二甲基亚硝胺MRM1 | 74→44 | 6.952 | |
2 | N-二乙基亚硝胺MRM 1 | 102→85 | 7.533 |
N-二乙基亚硝胺MRM2 | 102→56 | 7.528 | |
3 | N-乙基异丙基亚硝胺MRM1 | 116→99 | 7.784 |
N-乙基异丙基亚硝胺MRM2 | 71→56 | 7.787 | |
4 | N-二异丙基亚硝胺MRM1 | 130→42 | 7.971 |
N-二异丙基亚硝胺MRM2 | 130→88 | 7.976 | |
5 | N-亚硝基二丁胺MRM1 | 158→99 | 9.497 |
N-亚硝基二丁胺MRM2 | 84→56 | 9.494 |
五种亚硝胺化合物在10分钟内完全分离,且目标峰与溶剂和基质杂质得到了很好的分离(图 2)。由于使用了0.5µm膜厚的色谱柱,与 FDA 方法相比,分离时间更短。
图2:40 ng/mL系统适用性溶液色谱图,峰表见表3.
实验得出:N-二乙基亚硝胺(NDEA)和N-二异丙基亚硝胺(NDIPA)的多反应监测MRM Transition最低检测限浓度为2.5ppb,如图3所示。
图3 NDEA(上图)和 NDIPA(下图)最低检测限谱图
方法适用性
经验证的 FDA-OTR 方法要求 40 ng/mL 标准品六次重复进样的 RSD%≤ 5%。 使用我们的方法,连续6次进样 40 ng/mL 的5种亚硝胺杂质,在两种 MRM 下的 RSD%远小于 5,如表4所示。
化合物 | MRM1 RSD% | MRM2 RSD% |
N二甲基亚硝胺 | 1.8 | 1.3 |
N-二乙基亚硝胺 | 1.1 | 1.1 |
N-乙基异丙基亚硝胺 | 4.2 | 1.5 |
N-二异丙基亚硝胺 | 0.9 | 2.2 |
N-亚硝基二丁胺 | 4.3 | 3.0 |
表4 40ng/mL 亚硝胺标准品连续六次进样的精密度
此外,线性校准曲线的相关系数R2应≥ 0.998。本方法中五种亚硝胺杂质的两个 MRM都超过了这一标准(表 5)。
杂质 | MRM 1 | MRM 2 |
N二甲基亚硝胺 | 0.9994 | 0.9995 |
N-二乙基亚硝胺 | 0.9991 | 0.9995 |
N-乙基异丙基亚硝胺 | 0.9995 | 0.9995 |
N-二异丙基亚硝胺 | 0.9996 | 0.9994 |
N-亚硝基二丁胺 | 0.9983 | 0.9981 |
表5 两种MRM定量中两种亚硝胺的相关系数 (R2)
缬沙坦制剂中亚硝酸胺的检测
在药店购买的缬沙坦药品中加入亚硝胺杂质,浓度为10 ppb(NDBA为40 ppb),5种亚硝胺的回收率在94.5%~105.7%之间。(表6)。
杂质 | 10ppb回收率 |
NDMA | 99 % |
NDEA | 103.5 % |
NEIPA | 94.5 % |
NDIPA | 103.9 % |
NDBA | 105.7 % |
表6缬沙坦药品中5种亚硝胺的加标回收率
对于缬沙坦药品中5种亚硝胺的检测,OTR 方法的定量限 (LOQ) 范围是 8 – 40 ppb,本实验方法的 LOQ见表 7。 LOQ 是根据每种化合物校准曲线信噪比 (S/N) 为 10 浓度计算得出的,并且通过缬沙坦片剂的标准添加实验进行了验证。 检出限LOD是信噪比 (S/N) 为 3 的浓度计算得到 。
杂质 | FDA方法 LOQ [ppb] | 本实验方法LOQ [ppb] |
NDMA | 13 | 3 |
NDEA | 8 | 5 |
NEIPA | 8 | 3 |
NDIPA | 8 | 5 |
NDBA | 40 | 32 |
表7 OTR和实验方法LOQ结果
结论
综上,参考FDA 建议方法,使用 SUPELCOWAX® 色谱柱通过 GC-MS/MS在 MRM 模式下可以轻松实现亚硝胺杂质的测定。所有亚硝胺化合物之间以及与溶剂和基质峰的分离良好,满足所有系统适用性要求。 该方法已成功应用于缬沙坦药物中亚硝胺类杂质的分析。
相关产品
描述 | 货号 | 链接 |
SUPELCOWAX® 10 气相毛细管柱30 m × 0.25 mm,0.50 μm | 24284 | |
SupraSolv® GC-MS二氯甲烷 | 1.00668 | |
N二甲基亚硝胺NDMA认证参考物质 5000 µg/mL甲醇溶液 | CRM40059 | |
N-二乙基亚硝胺NDEA 认证参考物质 5000 µg/mL甲醇溶液 | 40334 | |
N-亚硝基二丁胺NDBA 分析标准品 | 442685 | |
N-乙基异丙基亚硝胺NEIPA EP标准品 | Y0002262 | |
N-二异丙基亚硝胺NDIPA EP 标准品 | Y0002263 |
来源于:默克化工技术(上海)有限公司
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