世界电镜九十年之荷兰电子显微镜早期发展历史（上）

本文作者：Woutera van Iterson，荷兰阿姆斯特丹大学阿姆斯特丹生物中心、分子生物学研究所、分子细胞学部，摘译原文发布于1996年。

一、荷兰电子显微镜的起源

1939年，代尔夫特只是一个有着著名历史的小镇。1584年，被称作“荷兰国父”的沉默者威廉正是在这里被暗杀。而在代尔夫特的Nieuwe Kerk依旧可以找到奥兰治王室成员的墓穴。微生物学的创始人Antoni van Leeuwenhoek也在代尔夫特通过自制的玻璃透镜研究他的“小动物”。如果不是因为代尔夫特理工大学以及它的创新产业，代尔夫特在二战前留给人们的总体印象只是一座古老的城镇。在这本回忆录中，代尔夫特产业中一个特别的部分，即荷兰的精神象征法布里克（简称“酵母工厂”）扮演了一个重要的角色。

首先，在代尔夫特理工大学的技术环境中，酵母工厂为国家最重要的微生物研究传统的发展做出了巨大贡献。1885年，酵母工厂的总经理J.C.van Marken邀请M.J.Beyerinck加入工厂。Beyerinck于1895年成为微生物学教授，并被称为微生物学之父。1921年，A.J.Kluyver（微生物学家之父）接替了Beyerinck的工作。Kluyver将他的教授任期与酵母厂的咨询工作结合了起来。这些是如何与电子显微镜联系起来的？答案就是酵母细胞。

1939年夏天，代尔夫特理工大学有一名工科学生，名叫Jan B. Le Poole。Jan B. Le Poole（图1）向他的物理学教授H.B.Dorgelo提出了一个大胆的请求，即为他自己的工程专业制造一台电子显微镜。因缘际会之下，这时的时机恰好成熟。

图1 J. B. Le Poole博士，荷兰电子显微镜的创始人，荷兰电子显微镜学会的首任会长

彼时，Dorgelo、F.G.Waller（酵母工厂总经理）和A.J.Kluyver于1939年7月6日访问完柏林的西门子公司刚刚返回。而Kluyver很熟悉最近出版的微生物照片和电子显微镜提供的相对高放大倍数的照片。问题是，是否有可能用这样一种仪器来确定酵母细胞是否配备了一个带有染色体的真正的浓缩细胞核，或者它是否类似于细菌，是否可以在核物质和细胞质之间作出明确的区分？考虑到这个问题的实际意义，Waller、Kluyver与Dorgelo讨论后，此三人决定前往透射电子显微镜及其理论背景的圣地：战前的德国。早在1939年，西门子就根据von Borries和Ruska的设计，成功售出了第一台商业化的电子显微镜。它的放大倍数高达4万倍，分辨率比光学显微镜高得多，其价格约为80000荷兰盾（笔者注：按2022年5月汇率1荷兰盾约合3.37元人民币）。然而，该电镜与其提供的可能效果有一定出入。此外，在柏林，他们确实在电镜“高”放大率下观察到了酵母细胞，但那不过是一个“丑陋”的黑点，而在光学显微镜下，一个整齐的生物体，在细胞壁内具有原生质、液泡和各种其他结构，只有细胞核是暗黑的。

一般说来，当时这种生物研究工具是否有用颇具争议。在整个细胞都聚焦的情况下，人们能否分辨出重要的细节？此外，电子一直被认为是粒子，直到1924年，人们通过德布罗意的工作才意识到，电子也会像波一样传播。然而，这并没有改变这样一个事实，即微粒肯定会轰击，继而破坏有机材料。最重要的是，生命的本质在于细胞中高百分比的水，而细胞在仪器的真空条件下会发生脱水。当电子显微镜的发明变得更广为人知时，在某些生物学圈内能听到这样的说法：“电子显微镜只是收集了一些人工制品。”毕竟，瑞士的Frey Wyssling和其他人已经用间接方法充分分析了细胞的总体结构。关于生物膜的结构性质，重要的论文也几乎达到了分子水平。电子显微镜真的能给20世纪30年代这一重要的知识宝库增添什么吗？这些反对意见促成了代尔夫特理工大学未来年轻科学家的冒险，也成就了他们的幸运。

鉴于所有不确定性，年轻的Jan Le Poole渴望成为一名先锋，后来证明他很幸运。Jan Le Poole建立了一台两级电子显微镜，1941年可以拍摄第一张电子显微照片。然而，40k V的加速电压被证明是非常局限的。因此，Jan Le Poole决定与飞利浦物理实验室合作建造一台150k V电子显微镜。在埃因霍温的飞利浦，A.C.van Dorsten开发了一个非常稳定的150k V的部件，同时Le Poole在H.J.de Heer的协助下正在代尔夫特研究电子光学系统。在1944年春天的代尔夫特，全新的150k V电子显微镜被研制成功。

二、荷兰电子显微镜的早期组织

人们很快认识到，开发电子显微镜并研究其在生物学和其他学科中的应用需要成立一个组织和专项资金。1941年，TPD（Technisch Physische Dienst）由应用科学研究组织（TNO）和代尔夫特大学合作成立。

1943年11月1日，一个专门的电子显微镜研究所作成立，隶属于TPD，不过其预算独立。该研究所得到了代尔夫特酵母工厂、飞利浦、Van Houten、Algemene Kunstzijde Unie（AKZO）、喜力啤酒厂和TPD等工业的资助。后来，荷兰联合利华和荷兰皇家壳牌公司也提供了每年不少于3000荷兰盾的资助。该研究所由一个咨询委员会监督，技术和日常管理由Le Poole负责，而Dorgelo和Kluyver负责科学监督。

三、代尔夫特的电镜

我们来自Le Poole的小组，在荷兰从战争的苦难中解放出来之前，我们只能孤立地工作，因此几乎没有意识到电镜的设计包含了许多令人兴奋的创新。其中一项创新是在40倍放大的物镜和160倍放大的投影镜头之间增加了两个镜头。其中一个额外的镜头有一个小孔，可以使放大倍数在6400倍到80,000倍间连续变化。放大到6400倍时，电流通过所谓的衍射透镜（另一个更大孔径）。使用该衍射透镜，可以从小至3μm的样品选定区域获得衍射图案。并可以在电子图像和电子衍射间来回切换，这在代尔夫特已被发现可以用于粘土矿物的测定。选区衍射的原理先前已被H.Boersch发现，但当时Le Poole还不知道。引入中间透镜的另一个优点是电镜镜筒的高度减小，从样品到最终图像的总距离达到60cm。此外，LePoole引入了一种特殊的对焦装置，尤其在高倍率下，当荧光屏上的强度较低时，可进行精确聚焦。入射电子束通过聚光镜和样品中两组平行板间的横向电场，以50Hz的频率振动。当物镜没有完全聚焦时，这种振动会使图像模糊。这有助于聚焦，并大大提高了代尔夫特研究所拍摄电镜照片的质量。从那以后，这种“摇摆”的磁型版本成为飞利浦所有透射电镜的特征。

早期电镜中的图像场非常大（直径18cm），并投射到锥形烧瓶的底部，并转至荧光屏（图2）。通过在屏幕上方束流横截面足够小的位置引入35毫米胶片，可以在随后的照片放大中覆盖整个图像。发射电压在50-120kV之间变化，对于生物样品，电压越高，电子束的穿透力往往越强。

图2. 150 kV电子显微镜，像场投射到沉积在锥形玻璃烧瓶底部的荧光材料上

代尔夫特还研制了静电电子显微镜，该电镜于1951年由W.A.leRutte完成，在固定放大倍数下具有8nm的分辨率。1952年，Le Rutte发表了一篇关于他对静电电子光学贡献的论文，但由于当时电磁式电子显微镜的技术优势，这项工作被迫中断。

另一个有趣的发展始于1943年中期。早在1942年，由于酵母细胞体积过大，Le Poole就提议建造一个发射电压1 MeV的电镜，以提高电子对样品的穿透力。建造这种电镜，必须克服种种问题，因此最终决定在飞利浦研究实验室建造400 kV的显微镜。Le Poole设计了这个电镜的电子透镜系统，而飞利浦的Van Dorsten负责设计高压设备，Oosterkamp负责发射枪，Verhoeff负责装配。1947年，这台电镜安装在代尔夫特研究所。

四.代尔夫特电镜的早期工作

不仅是电子显微镜的研究，代尔夫特对于电镜应用的开展也比较早。在准备研制基础型150 kV电子显微镜的这些年里，旧的两级型电镜在用于检验Le Poole的新想法的同时，还用于科学研究。在这项工作的成功，很大程度上归功于Harrie de Heer引进了出色的拍摄技术。

生物学家A.Quispel于1942年10月开始在A.J.Kluyver教授的带领下担任研究助理。他做的第一件事是在单孔样本架上准备足够的“Geisselthallack”支撑膜。Quispel的任务是研究该电镜在生物学研究中的作用，尤其是研究酵母核中的染色体。为了做到这一点，Quispel开发了一种“染色”酵母核的方法，即与其他细胞相比提高对比度。这种选择性染色需要重金属，因此，他改变了Feulgen的方法，使用银及镧盐。然而，酵母没有揭示其染色体核的秘密，染色体核仍然处于漆黑一片的状态。Quispel接着尝试用蛋白水解酶使细胞质对电子束更透明。1943年9月，Quispel离开代尔夫特时，这项工作移交给了我，最初也得到了J. M. van Brakel的协助。然而，事实证明，对太大的酵母细胞进行研究还为时过早。

当时我们深受战争的压迫，但我们年轻，对这项工作充满热情。我们急切地研究了酵母细胞、噬细胞菌、疗养院医生用的结核菌、各种其他细菌以及土壤样品中的粘土矿物、颜料、金属和在35mm胶片上拍摄的各种其他物品。

五、战争快结束时的情况

1944年，150 kV电子显微镜及其所有改进装置投入使用，但仅使用了几个星期。随着1944—1945年饥荒的来临，国家的形势变得非常危急。盟军已经解放了荷兰的南部，但是盟军在大河附近被拦截。在那个冬天，在河流以北的我们食物配给量减少到每周800卡路里。大家在解决温饱与绝望中挣扎。没有电，客运列车也没有运行，我们只有木制轮胎的自行车用于运输。为了保全电镜的透镜等核心部件，大家不得不做好随时拆除电镜的准备。值得一提的是，飞利浦电镜高压发电机中的冷却油无意间为大家解决了一些生存难题，这些冷却油被分配给研究所的工人作为燃料，大家在家里用它来照明等。我们也积极参与地下活动，试图抵抗危险的压迫环境。曾经，德军试图逮捕所有18至40岁的男性在德国从事强迫劳动，大家不得不躲起来试图逃避。

六.解放以后

在加拿大军队解放的动乱平息下来之后，代尔夫特电镜被重新组装起来。但此时，自己也开始怀疑，在与世隔绝的环境下使用代尔夫特电镜开展相关研究，是否对促进电子显微学的发展具有意义。来自盟军国家参观者的反应给我们的印象是， Le Poole电镜或将是一种意义重大的仪器设备，但我们不能依赖这种仅有的“大家的印象”，何况，在埃因霍温的飞利浦根本不准备开始在商业基础上生产电子显微镜，因为该公司主要对销售数千台以上的产品感兴趣。有没有办法提高同事们的希望？答案是有的。首先，我写了一篇关于美国在电子显微镜领域活动的综述。之所以能够做到这一点，是因为1944年9月荷兰南部解放后不久，荷兰国家矿业图书馆（DSM）就有了专门的美国科学期刊。虽然很明显，美国科学家的工作是广泛的和令人印象深刻的，但这篇综述让代尔夫特的物理学家相信，他们的成就并没有白费。此外，我还与我的父亲讨论了他们的担忧。父亲既是一名科学家，也是荷兰国家矿业公司董事会成员，能够理解新仪器的重要性以及飞利浦的工业观点。飞利浦的总裁Anton Philips博士刚刚从英国回来，他在那里度过了战争的岁月。我陪父亲去了埃因霍温，在那里我们在总裁家里吃了午饭。Philips先生仔细地听着，因为他还没有听说过代尔夫特电子显微镜的构造，以及他的公司已经如此密切地参与其中。1946年1月，Jan Le Poole有机会访问英国，并参加了英国电子显微镜集团的一次会议。在那里，他最后的一丝怀疑消失了：代尔夫特电镜确实是一种创新。他在英国遇到了Van Dorsten，他们讨论了对商用飞利浦电子显微镜的要求。1946年1月，飞利浦董事会似乎改变了观点，开始准备推动电子显微镜样机的开发，商业生产电镜有了基础。该电镜在某种程度上可以在X射线设备业务部开发，但样机是在飞利浦物理实验室（后称为飞利浦研究实验室）制造的。后来，一个特殊的电子显微镜部门成为科学和工业下医疗系统集团（一个主要的工业业务集团）的一部分。回想起来，这是早期所有努力的真正结果。

1946年，飞利浦公司制造的电镜原样机在牛津的一次大会上展出，虽然当时这台“顽固”的电镜现场未能展示有用的电镜图片，但同样受到了人们的赞赏。（大会结束后，有人发现一个孔盘在运输过程中滑出了立柱，从而阻挡了电子束。）下一步，飞利浦决定建立一系列的四台电子显微镜原型机，其中一部分零件将在莱顿大学 Kamerlingh Onnes实验室的仪器制造商学院进行制造。

飞利浦EM100的最终设计于1947年完成。一个独特的早期特征是荧光屏在透射中观察并倾斜到水平方向，如图3所示。在所有随后的飞利浦电镜中，这种结构被放弃，因为垂直柱比倾斜柱在机械上更稳定。

图3 飞利浦EM100

七、战后时期

代尔夫特研究所的工作人员逐渐增加：有4名物理学家、1名生物学家、1名工程师、2名仪器制造师和4名技术人员。从1946年起， Le Poole得到了J. Kramer的协助，J. Kramer在过去的36年中一直是Le Poole的得力助手。

1946年，物理学家的首要任务是校正电镜的像散，提高高电压稳定性，以及进一步发展一种更强的物镜，即在不需要进一步稳定透镜电流和高电压的情况下充分降低色差。包括其他工作在内，这项工作为飞利浦简化电子显微镜的设计提供了背景。

除了电子显微镜的发展外，仪器的使用也变得越来越重要。后者包括微生物学方面的研究和为研究所以外的客户所做的工作。三台电子显微镜确实不是一件奢侈的事，但当时只有一台，并且为了仪器研制，有时不得不将这台电镜拆开。

电子显微镜的质量体现在制备好试样的显微图片的质量上。当时，样品制备技术也正处于开创性的阶段。即使是主要用于生物标本的90kV，这些样品要么太脆弱，缺乏图像对比度，要么像酵母细胞一样太厚。在拍摄来自Lisse花球研究实验室的植物汁液样品时，缺乏对比度尤其令人不安，因为在这些样品中必须识别病毒棒。通常，我拍摄这些病毒时甚至都无法观察它们。在马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院的RalphW.G.Wyckoff博士来访后，我们对阴影投射技术有了很大的了解。这实际上为带有长鞭毛的细菌的电子显微照片（图4）和许多其他样本增加了一个新的维度。1947年，我有幸在贝塞斯达的国立卫生研究院获得奖学金并前往美国工作。那年12月，在费城的EMSA大会上，我提出了一篇题为《代尔夫特电子显微镜在生物学中的一些应用》的论文。在解释了代尔夫特显微镜的原理之后，投影了各种鞭毛细菌的显微照片，随后是为L.Algerica制作的叶绿体显微照片以及为Utrecht大学的L.H.Bretschneider制作的公牛精子显微照片。其中一张精子照片的特殊之处是用一种铁糖复合物喂养细胞，这是Bretschneider早期成功地尝试，目的是提高细胞代谢最活跃部位的对比度。

由于我去了美国，A.L.Houwink博士于1947年接替了我在代尔夫特的工作，他继续进行细菌鞭毛和一些原生动物的研究。

图4. 梅氏弧菌，视野7微米

当时在制备技术方面遇到的问题很大。TNO金属研究所的 J. A. Nieuwenhuis在1944年发展了复制技术，该技术被Dalitz和Schuchmann（1952年）以及Beekhuis和Schuchmann（1952年）发表。

1947年，高电压电镜从埃因霍温带到了代尔夫特，巨大的酵母细胞研究仍然令人失望。在高电压下，未经制备的酵母细胞以及真菌孢子，没有揭示重要的细节。此外，在这台高电压电镜样机准备就绪时，对这种仪器的需求已经消退。光束穿透的问题已经被一种新策略的发展所规避：薄片技术。因此，高电压电子显微镜的发展在1950年停止，但在1960年国际上对高电压电子显微镜的兴趣恢复后，以一种新颖的设计重新焕发生机。

L.H.Bretschneider（1949年）在Utrecht大学为他在代尔夫特的电子显微镜工作进行了这种薄片技术的实验。他和他的同事P. F. Elbers穿着厚重的外套，在4°C的温度下，用剑桥1890年产的摇式切片机将切片嵌入石蜡和硬蜡混合物中。1954年，这项技术在对蛔虫肠道细胞的研究中得到了进一步发展，其中在剑桥1952年产的显微镜摇式切片机上进行了冷切片。在同一研究所，Elbers构建了一种单通道旋转切片机，配有用于甲基丙烯酸酯嵌入的热扩展装置，并专注于电子染色的使用。不久之后，H.B.Haanstra（1955年）在飞利浦研究实验室成功地制造了一台简单的切片机，并于1958年获得了专利。

1949年7月，在代尔夫特举行的国际电子显微镜大会对荷兰所有电子显微镜学家来说都是一个巨大的鼓舞，在大会上，我们有机会展示我们的最佳成果，并与国外的同行结识。

八、20世纪50年代初：荷兰涌现更多电镜

当飞利浦公司开始商业化交付电子显微镜时，代尔夫特对电子显微镜研究的垄断宣告结束。1949年完成的第一个EM100，被送往哥本哈根的Statens血清研究所进行试验。在荷兰，每所州立大学都有自己的电镜，还有一些特殊的研究所也是如此，如利瑟的花球培养实验室、荷兰皇家贝壳实验室、Sikkens（一家油漆和清漆工厂），当然还有飞利浦研究实验室。

当然，正是代尔夫特的工作引起了大学和研究所的兴趣。然而，也有各种各样的失望，由于大多数大学对于电镜进行有序研究的要求还没有准备好，严重低估了电镜使用的实际意义，因此出现了各种令人失望的情况。

在格罗宁根大学（University of Groningen），E.H.Wiebenga教授为自己的研究做了充分准备，在美国Cecil Hall为其传授过蛋白质晶体(edestin and exalsin) 的制备；在英国，Wiebenga熟悉蛋白质的X射线衍射技术。1950年11月，他在学校拍摄出了第一张电子显微图片。然而，1951年10月，一名攻读博士学位的学生接手了Wiebenga关于种子球蛋白的工作，发现新安装的电镜无法使用。第一批电镜提供的分辨率约为5nm，不足以完成这类工作，他不得不使用X射线衍射技术。1952年前后，G.Boom对几种晶体材料表面结构的研究和E.F.J.van Bruggen对蛋白质变性的研究得到了新的物镜和更合适的制备技术（如负染法）的支持。这标志着格罗宁根大学在蛋白质结构化学方面卓有成效的研究工作的开始。

由于朱莉安娜女王的到访，瓦赫宁根农业大学有幸成为1951年首批安装EM100的学校之一。趁着飞利浦技术人员还在的情况下，非常聪明的女王及时喊道：“我什么都没看到！” 在最初的挫折之后，Christina van der Scheer 的工作在 S. Henstra 的协助下，主要关注病毒颗粒的研究

现在的工作人员很少意识到刚开始时遇到的困难。在阿姆斯特丹大学（University of Amsterdam），EM100于1951年1月交付，安装在一个地下室的自行车存放区，天花板低得足以磕头，没有通风。由于我们没有专项基金，电镜胶片必须用我的厨房用具来冲洗。尽管如此，在1953年，我还是在罗马举行的第十届微生物学大会上发表了一篇关于细菌鞭毛的特邀论文。1959年，我获得了科学博士学位，著有专著《不同视角下的Gallionella ferruginea》。早在1952年，在莱顿大学，之前提到的、和仪器制造学院合作制造的四台电子显微镜样机之一（不是Philips EM100）安装在医学院的解剖学大楼。电镜放在一个大房间中央的贝都因帐篷里。在W.G.Braams的看管下，它成为了一个规模不大的服务设施。电镜的应用还包括为医学生物学领域的未来研究提供基础。1957年，该电镜被Philips EM75样机取代。1958年12月，Braams被W. Th. Daems接替，W. Th. Daems和我们在阿姆斯特丹接受过电镜使用训练，在斯德哥尔摩的Sjostrand实验室接受过固定、嵌入和超薄切片的训练。1959年底，西门子Elmiskop I电镜取代了EM75，在酶细胞化学和放射自显影的帮助下，最终为形态学和细胞生物学研究奠定了基础。

在乌得勒支大学（the University of Utrecht），情况并不比在阿姆斯特丹容易。1952年3月20日，Utrecht EM100正式落成，但该仪器被放置在物理大楼里，距离L.H.Bretschneider（自1950年以来一直专注于细胞学和电子显微学）和他的同事P.F.Elbers（曾在巴黎接受W.Bernhard的培训）都不方便。直到1954年，生物学家才可以方便地每天使用电子显微镜。Bretschneider于1955年获得教授职位，并成为生物体亚显微研究中心负责人，Elbers负责日常事务。

直到1957年，奈梅亨大学（the University of Nijmegen）才安装EM100电子显微镜。在这里，首先为医学、及科学学院配置了一台电镜，由Bretschneider和Elbers的学生A.Stadhouders负责。这台电镜被安装的建筑物的地基恰好位于铁路站场共用的砾石床上！因此，在火车转轨过程中，电镜无法正常使用，直到确定并纠正了干扰源。奈梅亨大学的电镜装置迅速得到扩展应用，开展了重要的研究活动，主要是在人类病理学和植物学领域。

在飞利浦研究实验室，H.B.Haanstra多年来一直负责电子显微镜的研究。在20世纪50年代和60年代，他出版了大量出版物。

在代尔夫特理工大学，A.J.Kluyver教授的微生物学实验室安装了一台EM100，Le Poole研究所的生物学工作就此结束。在这里，A.L.Houwink与P.A.Roelofsen教授一起研究了植物细胞壁内的组织，这催生了“multinet growth”理论（1954年）。他和D. R. Kreger 博士一起研究了酵母的细胞壁（1953年）。Houwink于1953年在一种螺菌的壁上发现了晶体结构，后来加拿大的R.G.E.Murray对其进行了广泛研究，成为分子生物学的一个重要课题。

在Le Poole的电子显微镜研究所，在电镜仪器开发和电镜商业化方面的有趣发展在持续进行。1954年，Le Poole发表了博士论文《电子和电离光学的一些设计》。它包含了如此多的创新，以至B. Von Borries在贺信里写道：“这可能是三篇论文。”1957年，Le Poole成为代尔夫特理工大学的教授。他继续研究像散与磁透镜孔圆度不足之间的关系，以及通过校正各种像差来提高分辨率，多年来，图像质量的提高一直是他关注的焦点。

九、回顾过去

回想起来，一开始，生物学的主要困难之一似乎是光学显微镜所见与电子显微镜所见之间的差距。这需要很多年的时间来弥补这一差距，而这只有在光学显微镜专家开始使用电子显微镜专家开发的制备程序时才能实现。 此外，长期以来，电子显微镜学家对于他的物理学家朋友和传统生物学家来说，都是个陌生人。在电子显微镜照片上看到的东西在很长一段时间里都是纯描述性的形态学，那时分子解释过于投机。生物化学已经成为将超微结构研究引入分子生物学领域的主要支持之一。

第一批商业生产的电镜可能不足以满足所有电子显微镜学家的所有期望，但这也是对以后生产越来越优秀电镜的一种鼓舞。

早期在组织、技术以及纯科学方面的巨大努力为荷兰卓有成效的研究奠定了基础。

电子显微镜教会了我什么？ Kluyver教授在我的职业生涯中强烈地激励了我，他的伟大想法是他在生物化学中的统一概念。在我多年的积极研究中，我和许多研究人员都非常清楚，超微结构研究揭示了基本细胞结构的多样性的统一。在我晚年的思考中，这种统一对我们生活哲学基础的影响已经在我个人身上慢慢开始显现。

致谢

在本次审查中，下列同事提出了许多有用的建议:B. J. Spit, P. F. Elbers, H. B. Haanstra, C . C。E. Hulstaert, E. F. J. van Bruggen等。除此之外，它主要是基于我自己的笔记和回忆。

拓展阅读：捷克斯洛伐克电镜发展史系列

世界电镜九十年之怀念捷克斯洛伐克电子显微镜先驱——Delong、Drahoš和Zobač

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