回顾流式这三年——陈九武

本文作者：陈九武先生

【作者简介】

曾任教于华中农业大学，后在美国贝克曼库尔特公司，深圳迈瑞公司，凯杰公司，鹍远公司从事销售和销售管理工作。发表仪器有关文章数篇，参与编著《流式细胞术基本原理和实用技术》（华中科技大学出版社，2008），自有微信公众号《陈在不在》。

流式细胞术基本原理与实用技术（第三作者），华中科技大学出版社，2008. 获中国大学出版社第二届优秀教材二等奖

毛细管电泳在氨基酸检测中的应用，氨基酸与生物资源，2004,26（3）.

原子吸收光谱的背景吸收及仪器校正技术的发展，现代科学仪器，2001，（3）.

应用离子色谱分析食品中的痕量成分，湖北工学院学报，2000,15（1）.

这三年，一个很好的话题。

有人凤凰涅槃，有人点石成金，但更多是负重前行，不敢轻言放弃。

就笔者兴趣所在，梳理三年在流式界的耳闻目睹。疏漏在所难免，非图看官一笑，读者各取所需。

（本文有4个编号原创表，2个编号原创图，引用需注明出处。）

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 并购重组强者恒强 

并购年年有，这三年特别多。

表1总结了这三年（红色）以及上溯若干年的流式重要收购，忽略了收购后没有延续的业务。

特别瞩目的是以下两起：

2021年4月，DiaSorin公司宣布以18亿美元收购Luminex。Luminex是“流式荧光”技术的代名词，也曾在2018年收购Millipore Sigma旗下的Amnis成像流式和Guava毛细管流式细胞仪。

这桩交易令人关注的点在于，流式荧光和化学发光以怎样一种态势共处，是竞争，是互补？要知道，前者自上个世纪90年代推出后，被化学发光大品牌认为是自嗨，被流式主流从业者认为是小众，各种教材书籍倒是屡见不鲜，小而弥坚，到底其多参数的意义如何呈现？在Luminex这一领头企业被化学发光全球二线头品牌看中后，会迎来技术绽放的春天吗？

（在笔者发稿前一刻，纳市上市企业Cytek宣布收购Luminex流式荧光外的仪器业务，对Amnis和Guava这两个命运多舛的品牌来说，可能是一个最好的归宿。）

2021年7月，PerkinElmer公司宣布以52.5亿美元现金和股票组合的方式收购BioLegend，后者在流式试剂领域绝对数一数二，试剂品种过万。

从体量上归纳收购，无非是10+1，或者1+1。后者以1+1>2为结果的概率更高，而被体量数倍甚至数十倍，数百倍的企业收购，要么继续孤芳自赏，要不淹没于茫茫瀚海.....举个例子，1968年第一台商品流式细胞仪的生产公司现在销售额有多大？（纯属个人观念，请勿拍砖。）

HOWARD老爷子书中有“Big Three”的说法，早期是：BD，Coulter，Ortho，后来是BD Biosciences，Beckman Couluter ，DakoCytomation。今天是会有新的三巨头，还是BC，BD，Thermo，PE，Agilent，Cytek并驾齐驱，国内必达科系，迈唯层指等能否脱颖而出，让我们拭目以待。

表1 流式界收购大事记

 临床玩家日益增多 

2014年以前，国内临床流式市场完全是国外品牌的天下，并且仅仅是BC & BD。

而在今天已经有19家公司流式细胞仪经NMPA注册批准，其注册机器最高配置、TBNK试剂盒、细胞因子联检等配套情况见下表（绿色表示有）：

表2 NMPA注册流式细胞仪及临床试剂配套*

*C和L分别表示荧光通道和激光器，前面数字表示数量

临床流式更多玩家的加入，首先要得益于国家食品药品监督管理总局通告2017年第226号《食品药品监管总局关于过敏原类、流式细胞仪配套用、免疫组化和原位杂交类体外诊断试剂产品属性及类别调整的通告》，许多抗体归为一类管理。

在NMPA有较多备案抗体的公司，集中如下：

从仪器来看，六色荧光成为临床实验室流式基本配置，安捷伦、贝克曼库尔特、BD、层浪生物还升级或新推出了10色以上机器，聚焦全光谱流式的厦泰则有3激光38色的注册机器。

但是，从配套注册及备案试剂来看，10色以上应用还在无票乘车阶段。CD19、CD20、CD22、CD34、CD138等单抗及检测试剂盒等，需要注册，还是只有四家公司。

表3 NMPA流式注册（备案)试剂标记荧光染料

这三年，新的应用推出不多，这是临床流式从业者需要关注的核心。

·湖南湘奕注册了含线粒体染料Mito，以及初始T细胞表达CD45RA、CD62L的两个试剂盒，值得特别指出。市场推广效果如何不知，但至少资料罕见，也是奇事一件。

·人群结核分枝杆菌感染率23%，但只有5%~10%的人会由潜伏性结核感染者转变为活动性结核，结核感染免疫检测有QIAGEN，PE(收购T-spot）以及国内20多个品牌，参与者众。外周血CD161检测据信能辅助诊断活动性结核，深圳联合医学有备案试剂。这是笔者特别感兴趣的方向。

·CD64主要表达于巨噬细胞、单核细胞及树突状细胞表面，中性粒细胞和淋巴细胞表面几乎不表达CD64。当机体患感染性疾病时，中性粒细胞表面CD64表达迅速升高，淋巴细胞仍几乎不表达。 一般情况下，机体感染或内毒素入侵时，CD64在刺激后4～6h即可升高。与白细胞计数、C反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT)比较，CD64在诊断感染性疾病中具有更高的敏感性和特异性。当下CD64之推广需要统一指标。

·其它关注方向还包括（都是试剂盒，任重道远）：

·安捷伦PNH（阵发性睡眠性血红蛋白尿）检测套装，包含CD235a、CD59；

·美瑞特骨髓来源抑制细胞MDSCs、功能性NK细胞、颗粒素酶与穿孔素检测；

·活化血小板。

临床流式归根结底还是试剂和应用的竞争比拼。自主抗体，荧光标记和专家背书三者缺一不可。免疫力是疾病发作发展的根源，流式大有可为。

 多色分析试剂短板 

多色分析一直是流式“军备竞赛”的核心内容。不管是传统流式的单激光多色和多激光；还是光谱流式与质谱流式，本质上都是为了增加同时分析的参数数量。

传统流式：目前最高配置是48个荧光检测器。2019年在Front.Immunol.发表了一篇29色文章，紫外光激发7色，紫光激发8色，蓝光激发6色，561nm激光激发5色，红光激发3色。

光谱流式：荧光检测器从55个到184个。目前检索，最多色文章都是采用Cytek机器发表在Cytometry A上的文章，先有一篇Cytek员工自己做的40色，卡塔尔Hamad医疗集团其后发表了一篇43色文章。

质谱流式：理论上都是135个通道，目前实现了47参数方案。

图1是流式多参数分析（不包括散射及其它参数）的仪器现状。不看参数，看表现，对于流式厂家来说，突破29，43，47三个数字，比简单比较更香。

当然，可能首先要回答的一个问题是多参数的意义究竟有多大，一次分析43参数比58参数分两管好在哪里？

多色分析的关键不仅仅在检测器配置，以及数据处理能力。就目前而言，瓶颈还是在配套的荧光染料；对质谱而言，是同位素标记抗体。

我们从Cytek 卡塔尔43色谈开去，以下方案采用18种BD Horizon Brilliant染料，特别为紫外和紫光激发提供了最多选择；方案采用3种Biotium公司的CF染料，该公司提供超过30种CF染料，特别是红光和近红外激发，选择较多。Cytek公司自己的cFlour染料，在蓝光、黄绿光和红光激发上有更多选择。

荧光染料值得再写一文，这里不再赘述。但呼吁厂家不要盲目比较多色，自己先做出来有意义的结果发表再谈。这里的有意义不是纯粹技术上的，而是应用上的。

 流式荧光新机出现 

流式免疫荧光，又称液相芯片、悬浮阵列。相比化学发光，其最大优势是同时实现多参数检测，这是通过荧光编码微球来实现的。

Luminex流式荧光检测技术的核心为荧光编码微球，技术上采用不同荧光染料的配比。1999年推出，2007年新产品号称可以同时对1个样本中的500种不同目的分子进行检测，并且可以一次检测384个不同样本。上海透景、Bio-Techne、ThermoFisher等68家商业许可签约伙伴（38家诊断，30家科研），在使用Luminex-100/200或xMAP等相关技术平台。

中翰盛泰编码微球采用微米级球表面共价结合纳米级球的方式，微米球和纳米球分别有10种不同荧光染料浓度，微米球还可以加入不同大小。此编码模式获得更大的比表面积，更小的空间位阻。

在笔者看来，流式荧光技术未能取得与化学发光一样普及的根本原因，不在技术垄断，而在：1）应用没有更新，能做的活化学发光都能做；2）化学发光不强调一管多参数，但可以多参数分管检测；3）操作方便性。

目前流式荧光最瞩目的应用是细胞因子，这是这三年临床流式取得较快发展的第二个原因。根据法规规定，试剂盒需要注册，旷博、唯公、瑞斯凯尔、重庆博生特、赛基、湖南拜恩美等6家公司走在前面。

细胞因子的应用应当不局限于Th1/Th2/Th17等6因子，7因子乃至12因子检测。这三年，比较重要的进展在于

·赛基生物推出三款细胞因子试剂盒：

·首款炎症因子四联检试剂盒；

·肿瘤免疫评估六因子联检；

·趋化因子联检，免疫细胞诱导剂的监测。

·美瑞特推出移植物抗宿主病（GVHD）六因子试剂盒，包括IL-6、IL-8、ST-2、TNFR1、REG3α、Elafin，据信在注册之中。

 分选流式“以终为始”

 在体流式中国首发

2022年9月16日，光域生物医学发布全球首台在体流式细胞仪（in vivo Flow Cytometer, IVFC）。

IVFC-1000可直接，实时检测活体小动物外周血或淋巴循环系统中的细胞，分子，纳米颗粒等物质，可以说是实验动物体内环境真实状态的一种新视角。

图片来自生物谷

 流式图像趋向通用

细胞生物学两大技术平台：显微镜和流式细胞仪，前者以形态分析为优，可提供详细的细胞图像信息，但解释主观、费时费力；后者以统计学见长，却缺乏成像能力，无法获得细胞形态学和亚细胞定位等信息。

Amnis成像流式细胞仪率先将流式多色检测技术和荧光显微成像技术结合在一起，对细胞内或细胞间的信号分布进行定位和定量分析，既无须为了得到细胞群统计学资料而损失丰富的形态信息，也无须为了获得细胞细节而损失统计学功能。

当下流式趋向于将实时图像功能配合荧光检测器一并使用

·UB公司的气流分选COMPAS Vision

·Thermo Fisher公司2021年6月发布Invitrogen Attune CytPix，在4激光14色，及特有的声波聚焦流式基础上，同时捕获高分辨率的明场图像，6000张/s，0.3μm/pixel，分辨率0.6μm，检测限0.8μm，结合形态学和荧光产生新的分析方法......

·BD公司2022年发布的FACSDiscover将全光谱分选流式和图像分析结合在一起，能够以每秒15,000个细胞的速度捕获流经系统的单个细胞的图像。

引入新的流式仪器分类，见图2：

 流式自动化

流式在临床和工业市场取得突飞猛进，自动化的开发首当其冲责无旁贷。

这三年，值得记录的进展是：

·重庆微浪生物的FlowUltron-R100，采用专利的微流换液装置，免除了离心过程，据称细胞保存率高，细胞活性高，降低染色背景。这一改进措施对自动化的最大意义是容易实现操作。

·Curiox公司的AUTO 1000层流洗涤技术取代传统的离心洗涤，每个样品板包含一系列亲水点，悬浮细胞可以通过重力停留在这些点上。每个点周围的材料都是高度疏水。每个点可以将多达 1000 万个细胞清洗成单个细胞。卡塔尔43色文章据称也采用了这一技术。

·赛基生物 CGFlowStar流式全自动样本处理系统，集加样、移液、孵育、离心等步骤。

最后一个问题，流式的市场容量到底有多大？这是最近被问到比较多的问题。

笔者的回答是，首先要看你自己的目标是几个小目标？

Markets & Markets每年说法在变，2021年流式细胞仪的全球市场达43亿美元，预计2026年达63亿美元，CACR为8.1%。

国内数据，BC& BD应该已经超过3亿美金，其它品牌加起来在1亿美金左右.....欢迎留言。