首创数字PCR法评估支原体肺炎病情和治疗效果

首都儿科研究所细菌学研究室主任袁静团队在新羿生物数字PCR平台上开发了一种创新的检测呼吸道样本中肺炎支原体的方法，为评估支原体肺炎患者病情发展和治疗效果提供了新的工具。题为“Absolute quantification of Mycoplasma pneumoniae in infected patients by droplet digital PCR to track disease severity and treatment efficacy”的论文2023年6月发表在了SCI期刊Frontiers in Microbiology上。

肺炎支原体是引起呼吸道感染，包括肺炎的主要致病菌，严重者会造成肺外并发症，如心血管、胃肠、肾脏及中枢神经系统功能障碍，对广大人群，特别是儿童的健康造成巨大威胁。国家疾病预防控制中心一个历时11年的呼吸道传染病监测项目的数据显示，在引起学龄前儿童细菌性呼吸道感染的病原体中，肺炎支原体占比最高，达56.7%。

由于能引起呼吸道感染的病原体种类众多且症状相似，加上肺炎支原体难以培养，因此，开发一种精确、高灵敏度的肺炎支原体诊断方法具有重要意义。目前，已经建立了多种用于肺炎支原体检测的核酸分子检测方法，包括PCR、实时荧光PCR、环介导的等温扩增和重组酶辅助扩增等，其中实时荧光PCR成为临床诊断的主流方法。但由于实时荧光PCR技术需要通过与标准曲线进行比较来确定样品浓度，使得它的定量结果容易受到标准品质量、扩增效率等因素的影响。而在精准医学中，为了跟踪疾病严重程度和评估治疗效果，病原体核酸的准确定量变得越来越重要。

首先，研究人员同时用数字PCR法和实时荧光PCR法检测带有肺炎支原体基因序列的质粒，对比两种方法的灵敏度和定量准确性，两种方法的检测结果都具有很好的线性关系，见下图，但数字PCR法展现了更高的灵敏度，检测下限达到了2.9拷贝/测试，优于实时荧光PCR的10.8拷贝/测试。

数字PCR检测范围

实时荧光PCR法检测范围

然后，研究人员收集了178例患者的呼吸道样本，其中包括痰液样本、咽拭子样本和肺泡灌洗液样本，与实时荧光PCR法对比阳性检出率，实验结果如下：

如下表所示，数字PCR法检出80例阳性，而实时荧光PCR法少检出一例阳性。以数字PCR法的结果为标准，实时荧光PCR法的阳性预测值是98.75%。

在该项研究中，研究人员不仅对比了数字PCR法和实时荧光PCR法的性能，还进一步对数字PCR法在跟踪疾病严重程度和评估治疗效果的应用前景做了系统性研究和验证。

一、数字PCR法定量结果与疾病严重程度相关性研究

为了探索数字PCR法在监控支原体肺炎病情发展的可行性，研究人员将患者按照临床症状的严重程度分成了严重支原体肺炎（SMPP）和普通支原体肺炎（GMPP）两组，两组样本的数字PCR法检测结果如下图：

从检测结果可以看出，严重支原体肺炎组（SMPP）的肺炎支原体拷贝数明显高于普通支原体肺炎（GMPP）组（P<0.001），而且呈现比较好的集中度。这证明了数字PCR法可以准确的定量临床样本中的肺炎支原体，为判感染程度提供可靠依据。

二、数字PCR法监测患者样本中支原体浓度的动态变化

本项研究中对6个支原体肺炎患者（C、E为SMPP，其余4例为GMPP）治疗前和治疗后分别做了2-3次采样，利用数字PCR法监测了整个治疗期间肺炎支原体浓度的动态变化，结果见下图：

（2d PTA：入院前2天，AZM 1d：阿奇霉素治疗第1天，AZM 3d：阿奇霉素治疗第3天，AZM 5d：阿奇霉素治疗第5天）

所有患者在进行阿奇霉素治疗后肺炎支原体浓度均显著下降，这反映了抗生素治疗的效果。其中，患者A在阿奇霉素治疗后肺炎支原体浓度出现波动，先升高后降低，其入院前2天样本中肺炎支原体浓度较低，这可能是因为患者A当时处在感染的初期。

本项研究中，袁静主任团队开发的数字PCR法在检测肺炎支原体时展现了比实时荧光PCR法更高的灵敏度，以及很好的对不同浓度样本定量的精准度。进一步，实验证明该方法能够准确定量各种呼吸道样本中的肺炎支原体，不但准确的区分了严重支原体肺炎（SMPP）和普通支原体肺炎（GMPP）两组症状不同的患者，而且可以精准监测患者在治疗过程中体内病原体浓度的变化。研究结果证明，该方法可以作为评估支原体肺炎患者病情发展和治疗效果的优秀工具，并且为数字PCR法监控感染性疾病病情发展和治疗效果的方法的开发提供了有力佐证。