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2023.9.25
应用单细胞ICP−TOF-MS评估细胞的应激反应
TOFWERK
icpTOF
单细胞-电感耦合等离子体-飞行时间质谱法(sc-ICP-TOF-MS)是一种能自动且直接检测单个人体细胞中蛋白质相对浓度的分析方法。也可以进一步采用金属纳米簇(Metal Nanocluster, MNC)标记目标蛋白抗体和钌红(RR)染色来确定单细胞数量以及评估细胞的相对体积。作者通过sc-ICP-TOF-MS对人体ARPE-19细胞进行系统性研究,以探究这些细胞中经过IrNCs、PtNCs和AuNCs标记的特异性抗体铁调素(HP)、金属硫蛋白-2(MT2)和铁蛋白(FPN)的表达情况。考虑到APRE-19细胞在悬浮液中呈球形且RR与细胞表面结合,则细胞体积与Ru信号强度的二分之三次方成正比。这样不仅可以确定每个细胞中目标蛋白质的质量,有了体积信息后,还可以推导出相对浓度。研究人员比较了高血糖应激和氧化应激两种模型下的ARPE-19培养物,对照组与实验组细胞显示了分析物的质量、细胞体积和目标蛋白质浓度的相对变化,从而可以清楚地识别出经过相应处理后的细胞亚群。
01
简介
细胞的个体异质性意味着族群的细胞中金属和生物大分子的表达水平可以相差2到3个数量级。据报道,这种细胞间的显著差异可能是多种病症的根源。因此想正确解释细胞群中目标分析物表达必须能够对单个细胞进行定量分析。因为细胞转录组还受到细胞体积的影响,所以在分析细胞群中的目标分析物时,还需要评估单个细胞体积。此外,了解每个细胞的蛋白质量和特定蛋白浓度也是非常重要的。单细胞电感耦合等离子体质谱法(sc-ICP-MS)是一种应用较为广泛的技术,可用于研究细胞中的内源性无机元素和特定生物分子,新一代的飞行时间质谱仪(TOF)已经可以同时检测单个细胞内多个目标分析物。在以往报道中,这种技术被用于藻类元素指纹图谱、酵母对金属的吸收和对精子进行多元素分析。蛋白质质量通常在单个细胞中数量级为fg(飞克,10-15克)或ag(阿克,10-18克),因此抗体(Ab)标签必须有尽可能高的灵敏度。通常选用Maxpar聚合物作为抗体标记金属原子的载体(100-140个原子每Ab)。本文使用的金属纳米团簇(MNCs)可以提供更高的信号放大率,比如AuNCs和IrNCs中分别含有579和1760个Au和Ir金属原子。为了用sc-ICP-TOF-MS测定单个细胞中蛋白质浓度,需要选择合适体积标记物。以往的研究表明,Mg和Ca等内源性元素与细胞体积相关,然而同时测量极低浓度的Mg和Ca和金属标记物是一项极具挑战的工作(小编注:原文中解释为质荷比相差较多,这不是因为文中icpTOF仪器的TOF检测器所限制。更准确解读是因前端CCT模式下优化参数所限,不一定能对处于低浓度区间的低质量数和高质量数元素做到同时高灵敏度检测)。Rapsomaniki等人提出了一种方法,使用能与蛋白质氨基共价结合的Ru复合物,理想情况下,体积标记物只结合细胞膜,这样就能将金属信号强度与细胞体积相关联。
为了比较在不同补充剂条件下的细胞培养效果,获取每个细胞的相对体积至关重要。本研究首次提出了一种使用sc-ICP-TOF-MS直接测定人体单细胞中蛋白质相关浓度的方法。作者使用MNC标记的特异性抗体来检测目标蛋白,并使用RR染色来标记细胞体积。通过测量标记蛋白和101Ru+的信号强度,本文建立了一个简洁的自动化检测方法,用于比较不同细胞群体和评估应激细胞模型。本案例通过sc-ICP-TOF-MS对人类ARPE-19细胞的三种目标蛋白质表达情况进行了研究。这三种蛋白质HP,MT2,FPN分别被IrNCs、PtNCs和AuNCs标记,并随后进行 RR 染色。通过sc-ICP-TOF-MS对这些目标蛋白进行定量检测,作者为体外细胞研究带来了对细胞异质性的新认识。
02
实验方法
使用人类ARPE-19细胞和MNC标记的免疫探针进行免疫测定:研究人员使用MNC标记的免疫探针同时标记了固定细胞悬浮液中的三种蛋白质。用于在ARPE-19细胞中标记HP、MT2和FPN的免疫测定流程在免疫探针浓度方面已经进行了优化。优化可以确保蛋白质的完全识别,以及足够的清洗步骤以避免非特异性相互作用。此项流程是独立地使用三种免疫探针(Anti-h-HP:IrNCs、Anti-h-MT2:PtNCs 或 Anti-h-FPN:AuNCs)进行的。优化后的抗体浓度分别为 4 μg mL−1、10 μg mL−1 和 4 μg mL−1。为了对ARPE-19细胞进行RR标记,悬浮液中的细胞被浸泡在50 μg mL−1 的RR溶液中30分钟。之后,使用磷酸盐缓冲溶液(PBS; 浓度0.1M,pH值7.4)将细胞颗粒洗涤两次,以去除多余的RR。
实验先将ARPE-19细胞以1 × 105 cells mL−1 浓度悬浮在50 mM Trizma缓冲液中(pH值7.4),再进行sc-ICP-TOF-MS分析。作者经过连续稀释和测量对照组细胞来选择合适的细胞浓度。为进行离子校准,使用了含有Pt、Ir、Au和Ru的多元素标准溶液。每天分析两组悬浮液以确定sc-ICP-TOF-MS实验设置的传输效率。使用的两组悬浮液分别是商用含PtNP的标准试样以及含有ARPE-19细胞的对照组溶液。数据处理使用了TOFpilot、Excel和JASP软件。在STDS模式下优化ICP-TOF-MS参数,用于测量不同的细胞标签,而在CCTS模式下优化参数则用于检测细胞内源性元素。为确认基于MNC标记的免疫探针和RR标签的sc-ICP-TOF-MS方法,还使用商用ELISA试剂盒测定了对照组和高血糖处理的ARPE-19细胞中HP和FPN蛋白的平均浓度。
本文的sc-ICP-TOF方法中采用的是TOFWERK icpTOF 2R和ESI microFAST SC系统。ARPE-19细胞悬浮液的细胞计数通过BD Accuri C6细胞计数仪完成,同时使用Leica DM IL LED光学显微镜捕获细胞悬浮液的图像。使用Bandelin sonoplus HD2070探头进行超声处理,以配合ELISA试剂盒进行蛋白质测定。
03
钌红(RR)标记ARPE-19细胞:细胞区分和体积标记
为了更好地使用金属标记抗体对生物分子进行sc-ICP-MS分析,科研人员需要同步观测元素标签和细胞内源性元素(Ca, Cu, Fe, P等),从而确认细胞的完整性和抗体的正确识别。但由于内源性细胞元素和标签金属的质量差异,这种同时检测可能会受到限制。为了解决这一问题,研究人员使用RR来检测单个ARPE-19细胞,而其与MNC标签之间的相近的质量允许同时以高灵敏度检测。实验中,科研人员注意到纯RR信号可能与ARPE-19细胞的膜片段相对应,而MNC标签信号可能来自未结合到蛋白质的自由MNC标记免疫探针。此外,使用RR不仅可以确定细胞事件的数量,还可以评估细胞的相对体积,从而允许在每个细胞中确定目标蛋白的质量和相对浓度(小编注:具体计算公式和过程请参考原文)。最后,结合同期的光学显微镜观察到的细胞体积差异,RR信号范围还被用来识别多个细胞事件,从而确保单细胞数据评估的准确性。
04
压力下ARPE-19细胞的蛋白质水平
研究探讨了在两种不同条件下培养的ARPE-19细胞中三种蛋白质的表达:一种使用高血糖模型(100 mmol 葡萄糖,48小时)培养,另一种使用诱导氧化应激模型(5 mmol AAPH 1小时)培养。通过sc-ICP-TOF-MS分析实现了对单细胞中HP、MT2和FPN蛋白质的同时检测以及它们相对浓度的确定。为此,通过应用选定的阈值从背景中鉴别出细胞事件后,将193Ir+、195Pt+和197Au+的强度信号转化为Ir、Pt和Au的绝对质量。然后,将每个细胞的金属质量转化为相应的蛋白质含量(小编注:具体计算公式和过程请参考原文)。最后,使用单细胞测量的101Ru+信号强度计算出单细胞体积从而得到蛋白质的相对浓度。研究中使用单细胞ICP-TOF-MS得到三种蛋白质的检测限分别为HP是3.8 ± 0.4 ag/细胞,MT2是9 ± 1 ag/细胞,FPN是4.4 ± 0.6 fg/细胞。
05
高血糖对ARPE-19细胞的影响
利用 sc-ICP-TOF-MS 测定对照组和高血糖处理的 ARPE-19 细胞中 HP、MT2 和 FPN的水平,研究人员评估了高血糖对三种蛋白质产生的影响。如原文中表1中结果所示,高血糖(GL)处理影响了全部三种蛋白质的平均质量,它们均发生了过表达。但在比较相对蛋白质浓度时,平均值没有明显差异。图1的A-C比较了对照组和高血糖组HP、MT2和FPN的质量分布,高血糖组的细胞平均值明显较大(注意图中y轴是对数坐标),而中值不受影响,高血糖处理的细胞蛋白质量在中位数上下分布更为分散。因此,如果只比较群体平均值(如使用传统的ELISA试剂盒法),可能会影响到诊断和治疗效果。高血糖处理扩大了两极分布,表面上看HP、MT2和FPN在细胞群里质量变化较大,而相对浓度(图1 D-F)差异有所减小。此外,每个细胞的蛋白质分布直方图(图1 A-C)呈倾斜状,中位数以上的离散度大于中位数以下的离散度,当考虑到细胞体积时(图1 D-F),峰形不再倾斜,表示蛋白质质量较大的浓度体积也较大,但在直方图里可以观测到两组细胞群。
图 1. 用sc-ICP-TOF-MS测定对照组(绿色)和高血糖处理(橙色)的 ARPE-19 细胞中的HP、MT2和FPN的质量的箱形图和直方图(百分比表示)(A-C)以及相对蛋白质浓度(D-F)。(A、D)HP(B、E)MT-2(C、F)FPN。数据包括四组生物重复的对照组和高血糖处理的 ARPE-19 细胞的分析结果,每次重复都进行了三次仪器测量。
图2研究了蛋白质质量和细胞体积之间的相关性,蛋白质质量较大的细胞群在散点图上半部分用红色标出,质量较小的细胞在底部用绿色标出。图2的B、C显示的红色圈部分的细胞群中的细胞体积与蛋白质量之间呈线性增长关系,即细胞体积越大,蛋白质量越高。高血糖组(图2 D-F)也观测到了相同的趋势,但MT2和FPN中红色标记组的比例更高,意味着经过高血糖处理后,有更多细胞的体积与这两种蛋白质质量成线性关系。
图2 用sc-ICP-TOF测定的对照组和高血糖处理组的HP、MT2和FPN蛋白质质量与细胞体积的散点图。A-C为对照组,D-F为高血糖组。101Ru+信号是和金属纳米簇免疫探针的金属信号同时被测量的。红色椭圆代表蛋白质质量较大的细胞群,绿色椭圆代表蛋白质质量较小的细胞群。
为了评估细胞体积是否受到处理方法的影响,研究人员对101Ru+信号强度也 进行了研究(原文图S4)。对于较大的细胞,对照组和高血糖处理组观察到相同的分布,然而对较小的细胞,明显有不同的趋势:低于65cts3/2的细胞中,只观察到对照组细胞(即此区间未发现高血糖处理的细胞),而在65-140cts3/2范围,对照组细胞比高血糖处理的细胞数要多,平均101Ru+信号强度明显大于高血糖处理的细胞(p=0.04),表明高血糖会增大细胞体积,与文献中对应酵母细胞结果一致。此外,高血糖会诱发氧化应激、脂质过氧化和细胞凋亡,并抑制细胞增殖,这可能会改变抗氧化剂和控制金属稳态的蛋白质水平。
为了验证该方法的有效性,研究人员使用商用ELISA试剂盒进行了对比实验。在高血糖处理过的细胞中,HP和FPN的平均质量均出现过表达,两者变化倍数均为1.4。在95%置信度下的t检验显示,对照组和高血糖处理的细胞之间存在显著差异(p值分别为5 x 10-4和2 x 10-6),在sc-ICP-TOF-MS结果中也发现了同样的趋势,HP和FPN的变化倍数分别为1.4和1.3。因此,sc-ICP-TOF-MS获得了与细胞生物学常用技术很高一致性的结果。不过需要强调的是,ELISA分析只能获得细胞培养物中蛋白质的平均含量,而sc-ICP-TOF-MS可以获得每个细胞的蛋白质质量,并考虑细胞体积,而不是整体细胞群的平均值,从而能够更好地理解细胞应激反应背后的生物机制。
06
诱导氧化应激对APRE-19的影响
作者使用同样方法研究了对照组和AAPH处理的氧化应激APRE-19细胞中HP、MT2和FPN的含量。图3描述了比较蛋白质质量分布(图3 A-C)和蛋白质相对浓度分布(图3 D-F)。从图3 A-C可以看出,氧化应激状态下单细胞的HP和FPN平均蛋白质质量增加,而MT2无明显变化。每个细胞HP蛋白质量的中位数无明显变化,而MT2和FPN中位数却有所下降,分别从 1.41 ag/cell 降至 1.23 ag/cell 和 从0.81 fg/cell 降至 0.69 fg/cell),这些差异都有统计学显著性。三种蛋白质的平均相对浓度都有所下降(图4 D-F),但对照组和氧化应激组细胞之间的FPN浓度差异并不明显。
图3 用sc-ICP-TOF-MS测定对照组(绿色)和氧化应激组(橙色)的ARPE-19细胞中的HP、MT2和FPN的质量的箱形图和直方图(百分比表示)(A-C)以及相对蛋白质浓度(D-F)。(A、D)HP(B、E)MT-2(C、F)FPN。数据包括四组生物重复的对照组和氧化应激处理的 ARPE-19 细胞的分析结果,每次重复都进行了三次仪器测量。
图3 A-C中三种蛋白质的直方图显示了两种处理方式的细胞都属于一个大细胞群。然而考虑到细胞体积时,图3 D-F可以识别出几个大小不同的细胞群。对照组HP的相对蛋白浓度直方图(图3 D)有一个最大值,而氧化应激组细胞有两个不同的细胞群。图3 E中,氧化应激组中低蛋白质浓度的细胞比例比对照组更高。图3 F显示,两组都有两个不同细胞群,但是中浓度和低浓度FPN蛋白质浓度下细胞的百分比不同。
最后,图4展示了通过sc-ICP-TOF-MS得到的对照组和使用AAPH进行氧化应激处理的具有特定体积细胞的频率直方图。实验结果显示,与对照组的细胞相比,经氧化应激处理的细胞中具有高Ru信号(超过65 cts3/2)的细胞百分比更高,这意味着这些细胞的体积更大。AAPH是一种过氧自由基化合物,能增加活性氧种类的产生和通过改变细胞膜的透性增加细胞体积。因此,这种对比使我们能够得到关于AAPH处理的有趣发现,这些发现只能通过逐细胞研究细胞群体并考虑每个细胞的体积来得到。例如,与对照组细胞相比,AAPH处理的细胞中HP和FPN的质量更高,但该处理也显著增加了细胞体积;因此,这些蛋白质的质量增加不仅意味着处理后细胞内蛋白质浓度增加,也意味着细胞大小的增加。
图4 使用sc-ICP-TOF-MS获得的对照组(灰色,4635个细胞)和经过氧化应激处理(黑色,3505个细胞)的ARPE-19细胞体积频率直方图。
06
结论
研究人员需要了解每个细胞的目标物质质量、浓度和细胞体积的变化,才能评估细胞在不同外部刺激作用下的反应和相应机理。本文介绍的方法是通过sc-ICP-TOF-MS检测经金属纳米簇(MNC)标记的抗体作为蛋白质测定的特异性标签,以及使用钌红染(RR)作为体积标签,从而以高灵敏度定量测量单细胞中的特定蛋白质的质量,单细胞的相对体积和目标蛋白质的相对浓度。实验提出的自动化且简单的检测和数据处理方法可以处理大量数据并有效地比较对照组和处理过的细胞培养物,以获得可靠的结论。实验还可以评估每个单细胞中的蛋白质总质量,从而更深入了解细胞内发生的生化过程。
备注:
翻译仅供学习和参考,内容以英文原文为准。文中图片版权均归ACS杂志社所有。
TOFWERK icpTOF
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TOFWERK icpTOF电感耦合等离子体-飞行时间质谱耦合了Thermo 公司的 iCAP RQ平台和TOFWERK高性能飞行时间质谱。iCAP RQ平台提供了高强度并稳固的ICP进样和离子源,简单可靠的椎体和离子电镜和Q-cell科技。飞行时间质谱分析仪在保证跟四级管(QMS)同等灵敏度的同时,为icpTOF增加了快速全谱分析,更宽的线性动态范围和高达6000的质量分辨率,提供了快速全谱图采集和所有元素同位素的同步分析能力。
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来源于:南京拓服工坊(TOFWERK中国)
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