Cell重磅| Azure Sapphire助力揭示突触多样性的蛋白图谱

神经元使用不同的蛋白质组合建立突触接触，从而定义突触的特异性、功能和可塑性潜力，为学习和记忆的形成提供了分子基础。越来越多的证据显示，突触在结构和功能上有很大的多样性。然而，突触蛋白质组的多样性在很大程度上仍未可知。

作者使用荧光激活的突触体分选（FASS）制备纯化突触体，并耦合质谱仪进行定量 (图1A),开发了一套简化的工作流程，用于量化不同脑区、不同细胞类型突触的蛋白质组区域。将Gad2-cre（皮层抑制性）及Camk2acre（皮层兴奋性）品系与SypTOM品系杂交（图1A），主成分分析(PCA)显示与未分选的突触体的具有显著差异(图1C、1D、S1H和S1I)。定量显示，其富集程度最高的蛋白质几乎完全代表着现有的皮层兴奋性/抑制性突触标记蛋白(图1D和1E)。Camk2a::SypTOM中富集程度最高的20个蛋白中，有19个已在SynGO数据库有注释。证明此工作流程可从少量纯化的突触体中识别突触蛋白。

图1. 突触多样性、蛋白质组学的检测流程及验证实验(A)蛋白组量化的工作流程图(B) FASS等高线图。(C) Camk2a+与Gad2+突触体蛋白组的PCA分析。(D) Camk2a+及Gad2+突触体与对照突触体前体的蛋白富集差异散点图。(E) Camk2a+ (石灰绿色)与Gad2+突触体(玫瑰色)显著富集蛋白比对的火山图

作者随后将上述流程应用于来自5个不同脑区、4种Cre小鼠模型的15种不同主要突触亚型的蛋白质组学多样性研究。结果显示，不同脑区Camk2a::SypTOM及Gad2::SypTOM突触体的特异性有差别。但在突触体丰度、突触囊泡的大小或存在、突触线粒体或脑区之间的突触后结构方面无差异。PCA分析显示，与脑区相比，细胞类型对突触蛋白质组的影响更大。

作者共鉴定了15个突触蛋白质组超10,000种蛋白组，其中80%为syngo已注释蛋白，富集蛋白组>1,800种，并创建了一个交互式网络工具 (The Synaptic Diversity Hub, https://syndive.org/)，可供查询探索 。

在几乎所有突触类型中，突触囊泡泡atp酶(vATPases)以及介导突触囊泡内吞作用的蛋白质显著富集(定义为共享蛋白)。在所有脑区，Gad2:: sytom与Camk2a:: sytom富集蛋白很少重叠(约1%)。

某些蛋白家族如Rab、Vamp、Stx或Syt家族成员在兴奋性（Camk2a）或抑制性（Gad2）突触上表现出不同的富集特征。随后对这些蛋白质的一个子集进行免疫印迹实验，采用Sapphire激光扫描成像系统进行拍摄（Azure Biosystems）。结果显示，Vamp1, complexin-1/2, Syt2在Camk2a中相较于Gad2显著富集，而Syt12, Stx1a则在Gad2中更显著富集，证实了这些数据(图S4C-S4E)。免疫印迹和质谱分析之间有很好的相关性(Pearson’s r=0.95)。这种多样性表明，这些蛋白质可能以不同的方式调节相同的突触分子过程。

图S4.突触蛋白的共享和亚型特异性富集(C)免疫印迹验证（Sapphire 激光扫描成像系统拍摄）。(D)免疫印迹定量直方图。(E)免疫印迹与质谱分析相关图。

而在CX和HC中，>95%的CAMs（细胞粘附分子）仅富集于兴奋性或抑制性突触蛋白质组，具有高度的细胞类型特异性。综上，内吞作用和vATPases使用通用的突触蛋白模块，不因神经递质类型而异；而胞吐机制、突触前活跃区等则使用类型特异的蛋白质组。

作者将所有蛋白质模块与突触亚型的特征相关联，揭示了具有两个不同对立簇的蛋白-蛋白相关网络，分别具有与VGlut1或vGat高度相关或负相关的特征，代表不同细胞类型和大脑区域中与兴奋性或抑制性神经递质相关的蛋白质组。作者鉴定出188个和315个与VGlut1或vGat表达显著相关的蛋白，找到位于群落连接节点的核心蛋白(图4D) ，以及可能区分特定突触亚型的中度相关蛋白。另外发现130种与vGat表达以及158种与VGlut1表达显著相关的新突触蛋白。

基因集富集分析(GSEA)表明，vGat和VGlut1蛋白群落具有特异的富集途径或生物功能：VGlut1群落中突触后信号通路和树突棘相关蛋白显著富集(图4F) 。vGat群落中，GABA受体复合物的蛋白显著富集。鉴定出皮层和海马体中的22对蛋白质对，在兴奋性和抑制性突触中的富集呈显著负相关 (图4G, 4H) 。并发现一些新蛋白，可能在相同的突触分子过程中，参与调节突触的类型特异性。

图4.突触蛋白-蛋白相关网络(D)蛋白质节点与vGat免疫反应(上)及VGlut1免疫反应(下)的相关性(E) 与vGat免疫荧光显著相关模块中的蛋白质。(F) VGlut1和vGat蛋白群落富集通路的脊图。(G)皮层和海马Camk2a+和Gad2+突触蛋白质组中负相关蛋白对的热图。(H)负相关蛋白对的相关图。

为研究特异性与共享多巴胺能突触蛋白（其退化与帕金森密切相关），作者鉴定了在纹状体中，多巴胺能突触相比于其他14种突触类型的突触蛋白富集情况。显示多巴胺能突触中缺乏Oxr1可能导致氧化损伤的易感性(例如，在帕金森病期间)。而蛋白激酶Erk1 (Mapk3)通过在多巴胺能突触的特异性富集与帕金森病相关。相对于纹状体Syn1:: sytom突触，Dat:: sytom突触蛋白质组富集了参与多巴胺生物合成、运输和降解的关键蛋白。免疫印迹实验（Sapphire激光扫描成像系统拍摄）验证了这些发现 (图S6B)。此外，共享富集的蛋白包括vATPases、蛋白酶体亚基和内吞蛋白(图5F和S6C)。

图S6.多巴胺能蛋白组分析(B)验证Oxr1、Mapk3和Atp6v1g1在Dat+及Syn1+突触的富集或去富集。(C)突触前末端的Dat+和Syn1+突触中富集的选定蛋白。(D)突触体制备的不同组分的SDS-PAGE和免疫印迹。(E)原代大鼠皮质神经元PSME1免疫共沉淀实验的免疫印迹。(F)小鼠纹状体F2/3组分和纯化的20Si蛋白酶体的SDS-PAGE。图B、D、E、F均为Sapphire拍摄。

此技术流程同样可用于研究小分支或罕见细胞的突触类型。例如，作者成功的量化了Gad2:: sytom的抑制性突触蛋白质组。又在对皮质GABA能神经元亚类的研究中，分选得到的VIP+、PV+和SST+突触体（分别仅占所有颗粒的0.5%、3%、5%）的纯度均＞80%，且成功检测出其蛋白的富集。进一步分析显示，细胞类型的发育起源对皮质抑制性突触蛋白质组的影响不大。最后，作者发现了共600种与这三种抑制性突触类型的功能差异相关的蛋白质。

本研究开发了一套突触蛋白组的分子系统生物学分析框架。预计类似的实验策略可用于突触的多组学分析，研究其他生物分子(如聚糖、脂质或RNA)的突触多样性。未来，突触蛋白组也可与局部转录组整合描述RNA定位和局部翻译在突触蛋白质组多样性中的作用。此外，Cre/ lox系统等方法也将启发在细胞水平的研究。

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