【飞诺美色谱】Biozen dSEC-2分析单抗及聚集体的体积排阻色谱条件开发

概述

尺寸排阻色谱法 (SEC) 是根据药物大分子的流体动 力体积和尺寸进行分离的技术，对于大分子的聚集体分 析尤为适用。bioZen dSEC-2 色谱柱采用的填料为低孔 隙体积的硅胶，并采用了独有的亲水性二醇类键合表面 化学修饰来防止硅胶表面与蛋白质样品相互作用，提高 聚集体的响应和回收率。同时低孔隙率的硅胶提高了柱 子的耐压和批间一致性。另外，bioZen系列使用的 BioTi.钛金属硬件设计可以减少金属于生物大分子之间 的次级相互作用、残留以及进样到检测之间回收率低的问题。

当我们在开发一个SEC方法用于分析单抗的时候， 需要通过方法优化来抑制非特异性吸附，不同抗体理化 性质的差异，对流动相中盐的最佳浓度有所不同。理想 情况下缓冲液和盐的浓度根据抗体和实验要求进行优化， 但是当运行一个平台方法的时候， 往往需要连续分析 多个不同的抗体，所以我们需要一个通用的方法或者一 个方法优化的起始条件。

在本应用中，通过对比两种单克隆抗体的色谱表现 来探讨bioZen dSEC-2 色谱柱的通用性色谱条件，以帮 助节约方法开发的工作量和提高方法通用性。

关键词

SEC尺寸排阻色谱柱；抗体聚集体分析；bioZen dSEC； BioTi钛合金

实验部分

3.1仪器、试剂与材料

3.1.1主要仪器设备

Thermo U3000 高效液相色谱；

3.1.2试剂材料

实验用水为屈臣氏蒸馏水，磷酸二氢钠、磷酸 氢二钠、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、 氯化钾均为色谱纯。

3.1.3样品

英夫利昔单抗购自欧洲药典标准品，Anti-HEL-Human IgG1购自于当地生物制药公司，并根据 制造商的使用说明进行储存。

3.3仪器检测条件

3.3.1色谱条件

色谱柱： Biozen dSEC-2（7.8×300mm, 3μm, 200Å）；P/N: 00H-4788-K0

流动相：见表1；

流 速：1.0 mL/min；

波 长：214nm

柱 温：30 ℃；

样品浓度：英夫利昔单抗 5mg/mL

Anti-HEL-Human IgG1: 0.5mg/mL

进样量：10 μL；

3.4结果与讨论

3.4.1 磷酸钠缓冲液和氯化钠的浓度

在100mM磷酸钠缓冲液pH 6.8条件下考察不同氯 化钠浓度对两种单抗峰形和聚集体含量的影响，结 果表明，随着氯化钠浓度的提高，主峰拖尾得到抑 制，峰形变窄；当氯化钠浓度提到250mM以上时， 进一步增加浓度对峰形拖尾和聚集体含量只有很轻 微的改善，甚至没有改善的作用。参见图1-4。

在50mM磷酸钠缓冲液pH 6.8条件下考察不同氯 化钠浓度，可以观察到氯化钠浓度从250mM提高到 400mM后，峰型拖尾和聚集体含量仍然得到很小幅 度的改善。参见图5-8。

实验结果标明，在Biozen dSEC-2色谱柱对单抗类 型的样品聚集体进分析，使用50或者100mM的磷酸 钠缓冲液中加入250mM氯化钠，也就是总体的离子强度在300-350mm时已经基本对次级作用进行抑 制，改善主峰的拖尾和聚集体的分离度以及回收 率。当然如果采用更高的离子强度也可以，但是为 了延长色谱柱的使用寿命，我们还是建议采用尽可 能低的缓冲液和盐的浓度。

3.4.2 pH值的影响

通过对比100mM磷酸钠+250mM氯化钠，pH值 分别为5.8，6.2，6.8，7.4流动相条件。可以发现英 夫利昔单抗在pH5.8条件下没有检查到聚集体；随着 pH值增加，峰型拖尾逐步改善，聚集体含量也有所 增加，在pH6.8的条件下达到最优，随后在pH7.4峰 型有略微改善，但是聚集体含量有所降低。参见图 9-10。

图9 英夫利昔单抗 100mM磷酸钠+250mM氯化钠，不同pH条件下叠图

对于Anti-HEL-IgG1的情况有相似之处但不完全雷 同，随着流动相pH的增加，峰型也得到改善；聚集 体含量有所增加，在pH 6.8的条件下最优，随后在 pH7.4的时候，聚集体含量迅速下降。参见图11- 12。

pH值的变化可能对蛋白质结构和次级作用均有 影响，所以需要对生物分子的分离和定量分析造成 的影响进行评估。根据目前两个单抗样本的对比发 现pH6.8可能比较适合作为方法开发的起始点。

3.4.3 和USP通则方法的结果对比

美国药典(USP)通则<129>（重组治疗性单克隆抗 体的分析程序）中规定了体积排阻色谱(SEC)法测定 单抗的色谱条件谱柱，其色谱条件为 200 mM磷酸钾 和250 mM氯化钾，pH 6.2 。 通过对比可以看到在 dSEC-2色谱柱上，采用更低离子强度的流动相 （100mM磷酸钠缓冲液 pH6.8+250mM氯化钠，图 中标为“平台条件”）可以看到英夫利昔单抗在平台条 件下可以获得更好的分离度和聚集体含量。 对于 Anti-HEL-IgG1，平台方法的聚集体含量似乎更低， 实际上是因为在该条件下，单体的主峰面积更大导 致的。参见图13-16。

图13 英夫利昔单抗 平台条件和USP条件的对比

图15 Anti-HEL-IgG1 平台条件和USP条件的对比

结论

本文目的是对Biozen dSEC-2在对单抗及其聚集 体分析的SEC方法进行色谱条件摸索，希望找到一个 适合的方法开发起始点，具有好的耐用性和重现性， 作为平台方法同时分析多个单抗类大分子药物。

通过上述实验对比可以发现，缓冲液离子强度 对聚集体量有很大的影响，当氯化钠浓度从50升至 250 mM时，可以观察到更高的聚集体含量和更尖锐 对称的峰形，并且保留时间也趋于稳定。这说明流 动性中添加氯化钠可以使分析物和填料的次级作用 得到抑制。我们还观察到在相同离子强度和不同pH值下，聚集体的回收率有所不同 。根据本文中两个 抗体的数据，在pH6.8的情况下，可以获得最高的聚 集体含量和良好的峰型。

综上所述，可以将100mM磷酸钠+250mM氯化 钠 pH 6.8 作为Biozen dSEC-2色谱柱的初始条件，作 为平台方法用于同时对多个单抗样品进行分析，以 达到高通量筛选抗体的目的。

参考资料：

1.Analytical Procedures for Recombinant Therapeutic Monoclonal Antibodies. USP General Chapter <129>. 2022