FIDA解决一切分子相互作用难题，在原生条件下同步进行分子互作三个维度的表征

在分子互作研究的复杂世界中，获得更精确数据不仅是目标——而是必需。作为研究人员，您可能会遇到一些棘手问题：例如，我的实验数据是否是真实的生物条件反映？是否有我未能察觉到的关键信息？我该如何检测微弱的分子相互作用？等等。

在这种情况下，如果有一种技术可以保持样本原生条件，可提供多个正交、互补的解析维度，而且最关键的是同时同步获取多维读数的技术就显得尤为重要。层流诱导分散分析（FIDA）就是这样一种技术。

FIDA可通过三个维度的生物物理参数对分子互作进行分析——分别是第一性原理的Rh（水动力学半径），BRIC（结合依赖的荧光强度变化）和LD（Lambda Dynamics，光谱位移）。

• R_h（水动力学半径）反应分子在溶液中的粒径大小，FIDA通过第一性原理能够获得极其精确的绝对数值，分辨率低至1%的粒径变化追踪。分子粒径是衡量分子结构最为重要的参数之一，FIDA对粒径表征的高分辨率对于准确表征分子复合物至关重要。

• BRIC（结合依赖的荧光强度变化）作为一种基于荧光的读数，BRIC敏感地反应结合引起的分子构象变化，构象变化作为分子结构完整性的补充（粒径变化），BRIC显得尤为重要。

• LD(Lambda Dynamics，光谱位移）指的是当结合事件改变荧光团或其他光学标记微环境时，检测信号的波谱（lambda）发生的变化。这些变化为分子结合提供了额外的见解，提升了蛋白与小分子互作分析的解析度。

技术通过光谱位移（LD，Lambda Dynamics）、结合依赖的荧光强度变化（BRIC）和水动力学半径测量（R_h），为解析分子相互作用提供了独特的多维视角。这种整合提升了灵敏度和准确性，使得研究人员能够在原生条件下检测微小的分子变化和结合动力学，同时有效处理复杂样品。这种综合能力使FIDA在药物开发和生物标志物验证等领域具有广泛的应用潜力。

下面将详细介绍下BRIC（结合依赖的荧光强度变化）和LD（光谱位移）是如何捕捉更微弱的分子相互作用的。

BRIC（结合依赖的荧光强度变化）

什么是BRIC？

BRIC代表与结合依赖的荧光强度变化，是FIDA技术的一个重要方面。它测量当分子（如蛋白质或小配体）相互结合，或由于环境变化导致蛋白质改变其构象状态时荧光强度的变化。

BRIC测量可视化
峰面积 = 强度（总荧光）

BRIC读数提供了关于结合事件的信息，这些事件在复杂的生物环境中（如血清或细胞裂解液）可被灵敏的追踪。对于用户而言，BRIC与Rh可通过一次实验同时获得，后者提供了分子大小的绝对测量。拥有这两种正交读数使研究人员能够更全面、多维地理解分子相互作用。

淬灭效应与BRIC

荧光淬灭是指由于各种因素（如分子碰撞、能量转移或局部环境变化）导致分子（荧光团）的荧光减少的过程。当发生分子变化（如结合事件）时，例如配体结合到蛋白质上，它可以使荧光团靠近淬灭剂，或改变荧光基团周围的微环境，从而导致荧光强度的变化。

BRIC利用这些荧光强度的变化来检测和量化结合相互作用。具体而言：

• 环境变化：分子结合通常改变荧光基团周边的极性、pH或其他特性，这可能增强或减弱荧光。BRIC测量这些强度变化，提供有关结合动态和分子相互作用的见解。

• 静态淬灭：当结合事件导致荧光团和淬灭剂之间形成非荧光复合物时，荧光强度会下降。BRIC可以通过测量这种强度的降低来指示结合的发生。

总之，淬灭效应是BRIC检测分子变化（例如结合事件）的基本方面。通过监测由于淬灭引起的荧光强度的减少（或增加），BRIC为研究分子相互作用的发生、强度和性质提供了宝贵的数据。这使BRIC成为在各种研究和药物开发背景下研究生物分子相互作用的敏感工具。

在原生溶液条件中测量BRIC优势

首先，BRIC信号测量不需要温度变化（其他技术中使用温度变化来诱导荧光变化）。重要的是要注意，荧光强度在变化条件下测量的技术中，例如涉及热的技术，读数可能会变得不可靠甚至无效，因为样本的状态发生了变化。由于在FIDA中温度保持恒定，因此不会出现这种情况，条件保持原生。

其次，BRIC信号读值会自动调整以考虑基质复杂性。也就是说，感兴趣的信号被提取并从背景信号中分离，使得在复杂基质中容易进行实验设计。

因此，从实际角度看，使用BRIC技术具有几个关键优势：

• 保持原生条件：BRIC允许在生理条件下研究生物分子相互作用，在和小分子互作研究中可测量无标记蛋白质的BRIC变化，而不必因温度变化而破坏或改变分子的原生结构，从而提供更准确和可靠的数据。

• 与复杂介质的兼容性：BRIC在恒温下测量相互作用，且考虑背景噪音的干扰，使BRIC在分析复杂介质（如血液或血清）样本时尤其具有价值，在这些介质中，温度变化可能会妨碍样本的完整性，而这些样本又具有高度的复杂性。（FIDA技术通常与复杂介质和各种缓冲液高度兼容。）

Lambda Dynamics（光谱位移）

什么是Lambda Dynamics？

LD（Lambda Dynamic）的核心在于捕捉分子在溶液中相互作用时发生的微小发射光谱变化。波长位移变化数据携带着有关相互作用动态的宝贵信息。更具体地说，光谱位移是指在结合事件改变荧光基团微环境时，检测到的荧光信号波长（lambda）的位移变化。这些位移提供了关于结合相互作用的见解，并可能指示参与结合分子的构象、取向或接近度的变化。LD利用了被称为“lambda比率测量”的原理（Alexander Damchenko，2010&2014）。正如Damchenko所指出的，LD在研究分子间相互作用时特别有价值，因为它提供了比单波长测量更可靠和详细的读数。

在实际操作中，LD采用了波长比率测量的核心理念，并应用于增强生物分子相互作用研究的深度和可靠性。独特的背景扣除模式结合专有的FIDA技术，使得亲和力Kd和溶液动力学Kon/Koff的准确性都提升到现有互作技术无法达到的水平。

FIDA LD与其他方法的比较

我们将FIDA LD与不同测量方法获得的亲和力常数（Kd）比较。Fida LD中的每个结合曲线点均以三次重复进行测量（其它技术由于本身限制无法提供连续三次技术重复）。

本次比较的亲和力常数（Kd）是对应于酶碳酸酐酶与三种小分子抑制剂之间的相互作用。使用Fida Neo仪器获得的Fida LD的Kd值与其他溶液方法和表面等离子体共振（SPR）接近。并且在三对样品测量中均获得稳定数据结果， Fida LD方法的其他的优势包括快速的优化和测定、小样本体积（纳升-微升）以及附带的全流程质量控制（QC）。

FIDA LD的独特优势

LD对于专注于分子相互作用研究的科研人员具有无与伦比的优势：

1. 检测其它技术无法检测的：LD能够检测到其他测量或方法可能遗漏的微妙的波长位移。这种灵敏度的提高对于识别往往难以表征的复杂生物分子相互作用至关重要。

2. 效率：LD、BRIC、Rh同步进行测量：您可以通过一次实验获得三种测定结果。

3. 溶液动力学：与传统方法可能仅提供Kd确定不同，波长动力学允许量化这些相互作用的动力学，从而提供对当前系统的更细致和深入的理解。

FIDA技术通过光谱位移（LD）、与结合依赖的强度变化（BRIC）和水动力学半径测量（R_h），为解析分子相互作用提供了独特的三维视角，这些优势包括：

• 综合的多维数据：FIDA通过同时测量这三个维度，能够提供关于分子相互作用的更全面的理解。水动力半径（R_h）提供了分子或复合物的绝对大小，BRIC则敏感地捕捉到结合事件引起的荧光强度变化，而光谱位移（LD）则揭示了分子环境的微小变化。这种结合使研究人员能够从多个角度评估分子行为。

• 高灵敏度和准确性：FIDA的Rh可以检测到低至1%的粒径变化。BRIC则能够识别在复杂生物环境中难以检测的结合事件，而LD通过捕捉微小的光谱位移，进一步提高了对相互作用动态的敏感度。这种高度灵敏性使得研究人员能够检测到以前无法识别的复杂相互作用。

• 在原生条件下的分析：FIDA技术在恒定温度下运行，保持了生物分子的原生状态。BRIC和LD技术确保了在不干扰样品的情况下进行测量，这对于维持样品的结构和功能至关重要，特别是在复杂的生物介质中（如血清或细胞裂解液）。

• 动力学和亲和力分析：通过波长变化，FIDA能够提供关于结合动力学的实时数据，这有助于研究人员了解相互作用的速率和稳定性。同时，BRIC和Rh的结合也使得亲

• 和力常数（Kd）测定更加准确，揭示了分子之间的结合强度。

• 适用于复杂样品：FIDA在处理复杂样品时表现出色，其LD和BRIC能够自动扣除背景信号，确保从复杂的生物介质中提取出有意义的信号。这使得FIDA在药物开发、蛋白质-蛋白质相互作用及生物标志物验证等领域具有广泛的应用潜力。

FIDA 平台的选择

FIDA平台包括高通量、全自动的纳升移液主机，以及配置的独立的三个光学模块，分别是紫外光学模块用于Labelfree检测，以及蓝色和红色光学模块，与其它技术不同的是，FIDA主机可以灵活的配置最多三个光学模块，也可配置单独模块与用于特定的研究。FIDA配置的灵活性可以满足您当前的科研需求，而且方便的满足后续的技术升级，最具特色的溶液自由动力学模块也可以作为选择进行灵活配置。

FIDA正在中国进行火热的DEMO测试，如果您有任何分子互作技术上难以解决的问题，都可以联系我们，我们非常有信心，凭借第一性原理的技术以及独特的多维验证技术，FIDA一定是您最值得信赖的互作技术！

关于文章的详细内容，请参考FIDA官方网站，链接是：

https://www.fidabio.com/blogs

参考文献

FIDA

Demchenko, Alexander. (2010). The Concept of λ-Ratiometry in Fluorescence Sensing and Imaging. Journal of fluorescence. 20. 1099-128. 10.1007/s10895-010-0644-y.

Demchenko, Alexander. (2014). Practical aspects of wavelength ratiometry in the studies of intermolecular interactions. Journal of Molecular Structure. 1077. 10.1016/j.molstruc.2013.11.045.

Myszka, David. (2004). Analysis of small-molecule interactions using Biacore S51 technology. Analytical biochemistry. 329. 316-23. 10.1016/j.ab.2004.03.028.

Langer, A. et al. (2022). A New Spectral Shift-Based Method to Characterize Molecular Interactions. Assay and drug development technologies. 20. 10.1089/adt.2021.133.