导读:上周在佛罗里达州马可岛举行的基因组生物学技术进展年会AGBT上,Life Technologies表示其计划在年中发布Ion Torrent Proton II芯片以及PI芯片的升级版。
作者:Monica Heger
上周在佛罗里达州马可岛举行的基因组生物学技术进展年会AGBT上,Life Technologies表示其计划在年中发布Ion Torrent Proton II芯片以及PI芯片的升级版,可通过200个碱基对读数获得16千兆碱基数据。
Life Technologies声称,在去年的离子世界大会上,公司同样计划推出PIII芯片,该芯片可通过100碱基对读数获得64千兆碱基数据,但是最终通过400碱基对读数获得了256千兆碱基数据(IS 9/18/2012)。 Ion Torrent 公司的创始人Jonathan Rothberg说,在上周的AGBT上,公司尚未宣布此类芯片的发布日期。
“除开发Proton系统外,公司正致力于改善样品制备过程”, Rothberg说,“正如之前所宣布的,公司正在开发名为Avalanche的微乳液无PCR样品制备系统”。
公司正着力开发多种版本的Avalanche系统,包括可以在Proton芯片上直接构建测序文库的系统。 Rothberg说,公司研究人员已对协议进行了测试,并证实能完美读取近600个碱基。
Life Technologies产品营销高级总监Andy Felton解释说,公司仍在决定如何使Avalanche商业化,尤其是是否应使用磁珠配置进行处理或者就在芯片上进行简单处理。
Andy Felton未就向客户提供Avalanche的具体时间予以说明。
Rothberg说,目前在客户实验室和公司实验室的Proton系统上已经完成了逾12000次运行。
客户反馈
客户Joe Boland说,在AGBT举行Ion Torrent研讨会期间,美国国家癌症研究所实验室已采用六台Proton完成了逾200次运行,并对100多个外显子组完成了测序。Joe Boland还说,其已采用Proton进行了转录组测序检测,目前正在起草论文,对采用Proton进行的外显子组测序与采用HiSeq 2000进行的外显子组测序进行比较。
Joe Boland解释说,实验室每3.5小时平均可获得约12千兆碱基数据,以20倍的覆盖度覆盖几乎80%的外显子组。与实验室去年11月通常产生的8千兆碱基数据相比,这已是一大改进。Boland于去年11月(即最初安装系统两个月后)出席了美国人类遗传学协会大会。
目前,实验室每天能够对四到八个外显子组进行测序,在各芯片上运行一次外显子组测序。测序运行时间大概为三个半小时,而进行分析需要额外花费8到11个小时。
实验室目前完成了宫颈癌的外显子组测序研究。在110位女性中,选取24名采用Proton进行外显子组测序,其余采用Ion PGM的客制AmpliSeq面板进行筛选,以筛查与宫颈癌有关的所有已知基因。
对外显子组进行处理,研究小组建立更大的AmpliSeq面板,以囊括经由外显子组测序确认的新变种。
谈及与HiSeq的比较时,Boland说两个平台“在检测和calling SNPs时均运行良好”,两者的一致性高达99%,但是这两个平台仍存在着差异,“在插入缺失检测方面存在问题”,这将在下一篇论文中进行探讨。
对于采用HiSeq进行的外显子组测序,美国国家癌症研究所实验室采用Nimblegen的SeqCap v3捕获外显子组,而采用Proton时其使用的是Life Technologies的TargetSeq v2。
此外,Boland还说,实验室期望采用Proton开展转录组测序。对于实验室采用系统进行测序的首个转录组,Proton生成了5400万读数,由于实验室采用polyA 富集步骤(而非核糖体RNA损耗),核糖体RNA水平获得“大幅度提升”。自此,研究小组转向rRNA损耗。
实验室目前正在针对8个样本开展研究,产生300千兆碱基数据,并对三家公司(Seven Bridges Genomics、Station X和Partek)的生物信息学管道进行比较。
斯隆凯特林癌症纪念中心基因组学核心实验室的负责人Agnes Viale正采用纽约基因组中心的四个Proton系统(该系统目前已安放在其实验室),主要用于转录组测序。
Viale还拥有一台Roche 454 GS FLX、一台454 GS Junior、两台Life Technologies的SOLiD 5500系统(其中一台具有Wildfire升级)、两台Illumina HiSeqs(其中一台已升级到2500版)、一台Illumina MiSeq和一台PGM。
Viale在基因组生物学和技术革新大会上介绍说。四台Proton于去年9月安装在其实验室,12月开始首次转录组测序研究,
人类肿瘤和发病机制项目的肿瘤学家和研究人员Ross Levine计划开展转录组测序研究,以对具有FLT3/TET2突变的急性骨髓性白血病在小鼠模型内的表达进行研究。双重变异之前均产生了不良预后,实验室希望设计出一种小鼠模型,该模型可用于测试药物并获得生物洞察力。
Levine的研究小组希望快速完成用于研究的12个转录组,因此Viale建议采用最新安装的Proton系统。
从100毫微克总RNA中构建基因文库。在适配器连接、反转录、扩增以及大小选择后,接下来将进行的是rRNA损耗。之后,对样本进行测序。
Viale说,从样本制备到测序的整个工作流三天内可以完成。如果基因文库于星期一上午9点开始,则单触连接可于星期二下午4点开始,并可彻夜运行。可在星期三上午进行磁珠富集,大概中午开始测序,下午4点可以获得原始数据,Viale说。
这12个样本平均每个样本通过104碱基读数产生6200万读数,约为rRNA读数的5%。该数字为基因组图谱读数的85%到90%,转录组图谱读数的68%到75%。60%数据的质量评分达到20%或以上,Viale补充说。
RNA测序数据表明,具有适用于FLT3/TET2突变AML病例的“特殊基因信号”。
Viale还说,当实验室将采用Proton 进行的RNA测序与采用HiSeq的RNA测序进行比较时,结果非常相似,基因表达的一致性高达0.92。
Viale说,研究小组目前正在对甲醛固定石蜡包埋的样本进行RNA测序协议测试。 与Illumina相比,Proton的基因文库尺寸较小,使得该系统更适宜于此类样本。研究小组在室内对样本进行了测定,并将样本发送至Life Technologies。研究小组得出的结果与三天周转时间的结果一致。
Viale表示,随后其将采用Proton对ChIP测序进行测试,这与RNA测序相似,同为标签计数应用程序。 “对于该等应用程序,质量得分就显得不那么重要了”,Viale说。
例如,对于100个碱基读数,如果有3个碱基不匹配,则该读数仍可生成图谱,仍可用于查看基因表达。 但是,对于外显子组测序,您需要的质量得分应“尽可能接近完美”。
对于采用Proton进行的ChIP测序,Viale说,其将使用实验室的SOLiD和HiSeq系统对样本进行测序,以便对采用Proton获得的协议进行验证。但是,之后Viale希望查看FLT3/TET2突变样本的表观遗传,了解表观遗传与基因表达的关系。
Viale说。纽约基因组中心将使用Agilent的外显子组富集SureSelect应用程序,带头对采用Proton进行的外显子组测序进行验证,
来源于:Life Technologies
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