正常视网膜色素上皮细胞原代培养

2023/06/01   下载量: 0

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正常视网膜色素上皮细胞原代培养的实验材料准备以及实验流程分享给大家

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实验材料:

1. 材料来源:人眼、兔眼或者猪眼等;
2. 清洗液:不含Ca2+和Mg2+的1×PBS,添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素,pH7.
3. 特殊取材器械:眼球托与7-0尼龙线。以灭菌的白色橡胶反口胶塞作为眼球托;
4. 消毒液:200IU/ml的庆大霉素生理盐水;
5. 消化液:0.01%EDTA-0.125%胰蛋白酶的混合消化液;
6. 培养液:为含10%胎牛血清的DMEM培养液;
7. 培养器皿:培养瓶、24孔培养板或培养皿若干。

实验方法:
1. 摘取眼球,用200IU/ml的庆大霉素生理盐水浸泡消毒5min。沿锯齿缘后2—3mm处环形剪开眼球前段,去除角膜、晶状体以及玻璃体。分离去掉视网膜神经上皮层。将眼球后段制成眼杯;
2. 将眼杯置于眼球托(可以洗净消毒过的盐水瓶胶塞替代)上,取持针器用7-0尼龙线在4个对称方向上,把眼杯缝合固定在眼球托的壁缘上;
3. 用毛细吸管轻轻从眼杯中吸出视网膜神经上皮层。以PBS液漂洗眼杯2次,吸干;
4. 加入0.01%EDTA-0.125%胰蛋白酶的混合消化液,置于无菌的烧杯中。于37℃电热恒温培养箱中消化30min;
5. 吸去消化液。用PBS液稍洗。加入有血清培养液终止消化酶的作用,并用毛细吸管轻轻吹打眼杯内壁,以使视网膜色素上皮细胞脱落;
6. 收集眼杯内的细胞悬液,离心(800r/min)8min;
7. 弃上清液,将沉淀的视网膜色素上皮细胞重新用培养液悬浮。计数;
8. 以8×104—10×104个/ml的密度接种于培养瓶中;
9. 送入电热恒温培养箱中,按常规方法培养,每周换液2次;
10. 也可直接用机械分离植块法:用无齿镊撕下视网膜色素上皮细胞层,经PBS漂洗后,将其剪成1.5mm×1.5mm大小的组织块,直接接种于24孔培养板进行培养。

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