概述
本实验以50mM乙酸水和甲醇为流动相,使用Kinetex Biphenyl(2.1×100mm 1.7μm)色谱柱对维生素K1进行 测试,顺反式异构体可达到初步分离,出峰时间满足要求。
关键词
Kinetex Biphenyl;维生素K1
化合物信息
实验部分
3.1仪器、试剂与材料
3.1.1主要仪器设备
液相色谱串联质谱仪(AB SCIEX API 5500+),配 有电喷雾离子源(ESI);
超高效液相色谱仪(Thermo Ultimate 3000)
3.1.2试剂材料
实验用水为屈臣氏水;甲醇、乙酸均为色谱纯 试剂。
3.1.3样品
1. 维生素K1:客户提供(3.914mg);
2. 维生素K1上机液1:用4mL甲醇溶解样品,精 密吸取1μL于棕色进样小瓶中,用甲醇配制成 1mL(≈1μg/mL);
3.2仪器检测条件
3.2.1超高效液相色谱条件
色谱柱:Kinetex Biphenyl 2.1×100mm 1.7μm; P/N:00D-4628-AN
流动相:
A:50mM乙酸水;
B:甲醇
流 速: 0.2mL/min;
柱 温: 20℃;
进样量:5 μL;
检测波长:254nm
等度洗脱: A: B=5:95
3.2.2液相串联质谱液相部分条件
色谱柱:Kinetex Biphenyl 2.1×100mm 1.7μm;
P/N:00D-4628-AN
流动相:
A:50mM乙酸水;
B:甲醇
流 速: 0.5mL/min;
柱 温: 25℃;
进样量:5 μL;
等度洗脱: A: B=10:90
3.2.3质谱条件
离子源类型:电喷雾离子源(ESI)
扫描方式:多反应监测正离子模式(MRM+)
喷雾针电压:5500 V
离子源温度:550 ℃
加热器(GS1):55 psi
辅助加热气(GS2):55 psi
气帘气(CUR):20 psi
碰撞气(CAD):10 psi
为获得较好的稳定和灵敏度,各化合物监测离 子对的去簇电压(DP)和碰撞电压(CE),目 标化合物定量离子对参数经过系统优化,优化 信息参见表3。
3.3结果
3.4实验谱图
讨论
C18 类色谱柱上维生素 K1 出峰在百分百纯有机 相时,无法通过调整流动相来分开顺反异构体。在 HILIC 模式下,Luna NH2 可以对维生素 K1 有很好的 保留,但由于色谱柱柱效原因舍弃。实验又筛选了 Kinetex F5、Kinetex Biphenyl 及苯基-乙基柱,在 50mM 乙酸水和甲醇的条件下,质谱上可看到 Kinetex Biphenyl 对顺反异构体达到了初步分离。在 液相上通过优化柱温及流速,在 20℃ 0.2mL/min, 50mM 乙酸水:甲醇=5:95 条件下,分离度可达到 1.48,出峰在 10 分钟之内。
结论
本实验以50mM乙酸水和甲醇为流动相,使用 Kinetex Biphenyl(2.1×100mm 1.7μm)色谱柱对维生素 K1进行测试,顺反式异构体分离度1.48,可达到初步分 离,出峰时间满足要求。
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