方案摘要
方案下载应用领域 | 医疗/卫生 |
检测样本 | |
检测项目 | |
参考标准 | 液相色谱法 |
牛磺酸的HPLC法测定本用柱前或柱后衍生的方法,衍生试剂为2,4-二硝基氟苯(DNFB)、邻苯二甲醛(OPA)、异硫氰酸苯酯(PITC)及9-氯甲酸芴甲酯(FMOC)等。
牛磺酸是存在于动物以及人体内的非蛋白质游离氨基酸,它具有消炎、镇痛、解热、镇静、保护心肌、抗脑缺血及增强免疫力等作用,是人类必需氨基酸。
牛磺酸的含量检测方法较多,目前常用的方法有酸碱滴定法、分光光度法、气相色谱法、氨基酸自动分析法、荧光法及高效液相色谱法(HPLC)等。
牛磺酸的HPLC法测定本用柱前或柱后衍生的方法,衍生试剂为2,4-二硝基氟苯(DNFB)、邻苯二甲醛(OPA)、异硫氰酸苯酯(PITC)及9-氯甲酸芴甲酯(FMOC)等。
这里介绍用DNFB柱前衍生化法和梯度洗脱的方式分离各成分,建立人血浆中牛磺酸的定量测定方法。
方法仪器:高效液相色谱仪。
色谱条件:C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相A为0.05mol/L乙酸钠溶液(pH6.5),流动相B为乙腈-水(1∶1),梯度洗脱,流速为1mL/min,柱温30℃,检测波长360nm,进样量20μL。
溶液配制
流动相A:取无水乙酸钠4.1g,加水至1000mL,加乙酸10μL,配至浓度为0.05mol/L,pH为7.0;流动相B为乙腈-水(1∶1),超声除气;
磷酸盐缓冲溶液(pH7.0):取磷酸二氢钾6.8g,加0.1mol/L的氢氧化钠291mL,加水至1000mL,pH为7.0;
牛磺酸储备液:取牛磺酸20mg,加水定容至10mL,质量浓度为2mg/ml;
DNFB衍生试剂:取DNFB250μL,加乙腈至25mL,浓度为1%;碳酸氢钠溶液:碳酸氢钠21g,加水至500mL,浓度为0.5mol/l。其中,流动相A、流动相B、磷酸盐缓冲溶液和碳酸氢钠溶液均经0.45μm滤膜滤过。
测定:取人血浆样品500μL和乙腈500μL混匀10s,以4000r/min离心5min。取上清液600μL至5mL容量瓶中,加入碳酸氢钠600μL及DNFB375μL后,在60℃避光条件下水浴1h。取出后,加缓冲液至5mL容量瓶刻度,微孔滤膜滤过。取上清液20μL进样测定。
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